文摘
背景和目标疾病进展缓慢的和可变的贝克尔肌肉萎缩症(BMD)敦促生物标记的发展促进临床试验。我们探索的变化3 muscle-enriched BMD患者的血清生物标志物在四年时间和研究协会与疾病严重程度,疾病进展和BMD的肌营养不良蛋白水平。
方法我们定量测量肌酸激酶(CK)使用国际临床化学联合会的参考方法,肌酸/肌酐比(Cr / Crn)使用液体chromatography-tandem质谱,和肌肉生长抑制素在血清ELISA和评估功能性能动态评估使用北极星(NSAA), 10米运行速度(TMRv), 6分钟步行试验(6 mwt)、用力肺活量4潜在自然历史研究。胫骨前肌肌营养不良蛋白水平的量化使用毛细管西方免疫测定。生物标记物之间的关系、年龄、功能性能,年平均变化,预测的并发使用线性混合模型功能性能进行了分析。
结果34患者包括达106人次。8个病人nonambulant基线。Cr / Crn和肌肉生长抑制素非常耐心具体(组内相关系数= 0.960)。Cr / Crn强烈负相关,而肌肉生长抑制素是强烈与NSAA呈正相关,TMRv 6 mwt (Cr / Crnρ=−0.869−0.801和肌肉生长抑制素ρ= 0.792到0.842p< 0.001)。CK与年龄呈负协会(p= 0.0002),但不是与病人的相关性能。Cr / Crn和肌肉生长抑制素相关的适度的年均变化6 mwt(ρ=−0.532和0.555,p= 0.02)。肌营养不良蛋白水平没有与所选择的生物标志物和性能。肌肉生长抑制素,Cr / Crn和年龄可以解释75%的方差的并发NSAA功能性能,TMRv 6 mwt。
讨论Cr / Crn和肌肉生长抑制素可能成为监测生物标志物在BMD,更高的Cr / Crn和更低的肌肉生长抑制素是降低电动机的性能和预测并发功能性能与时代相结合。未来的研究需要更精确地确定的情况下使用这些生物标记。
术语表
- 6 mwt=
- 6分钟步行试验;
- ADP=
- 二磷酸腺苷;
- 三磷酸腺苷=
- 三磷酸腺苷;
- 弹道导弹防御=
- 贝克尔肌肉萎缩症;
- CK=
- 肌酸激酶;
- Cr / Crn=
- 肌酸和肌酐比 ;
- 简历=
- 变异系数;
- DMD=
- 杜氏肌萎缩症;
- FVC=
- 用力肺活量;
- 国际刑事法庭=
- 组内相关系数;
- NSAA=
- 北极星动态评估;
- 助教=
- 胫骨前;
- TMRv=
- 10米运行速度
贝克尔肌肉萎缩症(BMD)的特征是进行性肌无力造成的肌营养不良蛋白水平降低与异常的分子量。1临床试验的传导一直在挑战BMD由于发病率低(1:18,000男性活产,三分之一的杜氏肌肉营养不良症(DMD))严重妨碍病人招聘。2同时,高功能可变性和减缓疾病进展导致困难捕捉潜在的药物功效在审判。3因此,客观需要生物标志物可以促进试验设计和传导。4例如,患者预后的生物标志物可以丰富试验通过选择更大的临床事件的可能性,从而允许减少样本量最近了。5
循环生物标记感兴趣的,因为简单的可访问性,有限的病人负担,和相对较低的成本。他们也可能提供一个代表患者的整体情况。识别可能的血液生物标志物在DMD和BMD,分析执行通过几种方法包括大规模勘探“组学”的方法和更有针对性的方法,例如,调查基于假设的有限数量的分子或先前的研究。6,- - - - - -,11标记相关的肌肉结构或完整性的具体利益,因为替代脂肪,肌肉组织的病理学的突出标志肌肉营养失调等BMD条件。肌酸激酶(CK),常用的诊断的生物标志物在肌肉营养不良,可能不是最优监控疾病由于其血清水平的变化,因为膜病理和剩余的肌肉,旁边的其他因素如季节变化和身体活动的依赖。12或者,肌酸,来源于饮食或肝脏中合成,nonenzymatically转化为肌酸酐在肌肉以恒定速率。因此,肌酸的转化率肌酐更密切相关的保护肌肉组织,这种转换。同样,肌肉生长抑制素与肌肉,因为它是生产和发布的骨骼肌组织。它也作为抑制剂过度的肌肉的生长。13事实上,肌酸/肌酐比DMD患者水平增加,而血清肌肉生长抑制素低BMD和模式与健康对照组相比。14,- - - - - -,18尽管这些横断面研究提供证据表明,肌酸/肌酐比(Cr / Crn)和肌肉生长抑制素可能是合适的生物标记,他们的关系长期功能性能还需要很大程度上展示。这些数据对更紧密的定义很重要的潜在环境循环生物标记的使用。
我们量化CK、Cr / Crn和肌肉生长抑制素生物标志物在纵向自然历史研究的成年患者BMD和评估与疾病严重程度的相关性,疾病进展,预测能力的并发性能。
方法
病人特点和研究方案
参与者招募从荷兰Dystrophinopathy数据库4潜在BMD自然历史研究莱顿大学医学中心在2014年和2019年之间。19男性受试者年龄≥18年诊断出患有BMD基于以下标准纳入研究:基因确认(在坐标系基因变异)或另一个基因变异DMD基因与一个轻微的临床表型(ambulant > 16年没有类固醇治疗)。每年4天访问的研究方案由静脉血液采样和测量的几个功能测试包括动态评估北极星(NSAA), 10米走/跑测试速度(TMRv), 6分钟步行试验(6 mwt),肺功能(用力肺活量比例预测[FVC %])。功能测试是由2训练有素的观察员如前所述。20.,21NSAA也表现在患者失去了移动在研究过程中捕获函数在这个规模的下降。这些病人只能得分脖子弯曲(0 - 2分)或坐从仰卧位(0 - 2分)。患者也可以同意从胫骨前(TA)肌肉活检,在基线或第一年的学习。
标准协议的审批、登记和病人同意
获得的临床资料和人体组织,存储,严格按照指导原则和有关规定处理。这项研究是LUMC医学伦理委员会的批准。从所有参与者获得书面知情同意。
血液采样和分析
血液样本被允许凝块0.5 - 2小时在室温下血清中集合管(不锈钢,3.5毫升)。样本进一步离心10分钟20°C 2350相对离心力。整除的1.5毫升的血清被冻结在−80°C等待使用。分析肌酸和肌酐使用前面描述的方法进行。22总之,血清样本与内部混合标准解决方案(d3-creatine和d3-creatinine)。样品用乙腈脱去蛋白质。浮在表面的氮和下干derivatized与丁醇/乙酰氯的混合物。肌酸转化为其丁酯,而肌酐仍然underivatized,两人都以微摩尔每升。样本再次干下氮和重组在移动阶段。使用对称的化合物分离C18柱和MRM模式中发现使用串联质谱分析。
分析CK (U / L)是由比色(国际临床化学联合会)8000年罗氏Cobas方法。分析肌肉生长抑制素(pg / mL)是由ELISA使用工具包(猫。n。DGDF80)包括激活工具包(猫。794 n。DY010)和质量控制(猫。n。QC98)。所有产品从研发系统、Bio-Techne明尼阿波利斯,锰、美国、和程序根据制造商的说明进行。肌肉生长抑制素值的计算使用的四个参数执行物流(4 pl)回归。
所有分析都是在重复执行。样本的平均值是用于分析。样品被排除在外时,变异系数(CV)超过30%。
统计分析
Cr / Crn的纵向轨迹,CK,肌肉生长抑制素是使用线性混合模型建模25对数转换价值的生物标记,包括特定的随机拦截和年龄作为协变量固定效果。针对病人的随机山坡上没有说因为有病人和可用的数据点太少。使用受限制的最大似然估计模型。每个生物标志物在患者的异质性水平研究了利用组内相关系数(ICC)。线性混合模型与随机拦截,国际刑事法庭是一个估计的相关性重复测量相同的病人,它提供了一个指示如何从不同的患者分离的轨迹。随着年龄增长,生物标记测试协会使用方差齐性检验,Satterwhite自由度决定使用的修正。26多个测试修正实施使用Benjamini-Hochberg方法进行分析。27
患者至少2测量给定的功能测试,功能测试的平均每年变化估计由线性回归模型拟合与功能测试响应时间(年)作为协变量为病人所有可用的数据点。
生物标志物与疾病严重程度的相关性,疾病进展和肌营养不良蛋白比例患者通过测量之间的皮尔逊相关评估特定的随机拦截的生物标记和功能测试。随机拦截被解释为每个病人的偏差从研究群体的均值。
并发性能的预测使用线性模型计算了不同组合的预测因素(年龄、Cr / Crn CK、肌肉生长抑制素和抗肌萎缩蛋白)。预测性能测量optimism-corrected R2基于引导。28
数据可用性
匿名数据可以提供给合格的调查人员要求。
结果
36个患者中包括自然历史的研究。一个病人不同意血液取样,另一个病人因撤回同意排除基线后访问。剩下的34个病人共123人次。血清样本从17人失踪13个病人。CK水平没有分析在四年级的后续访问了19病人因为没有发现与功能测试前3年研究的初步分析。7更多的访问,肌肉生长抑制素水平无法确定(在4次,没有足够的样本,并在3访问,CV %太高了)。因此,Cr / Crn、肌肉生长抑制素和CK水平是在106年,99年和87的访问量。
所示的患者基线特征表1。八个病人nonambulant(定义为无法执行咯,不支持)在基线。三个病人失去了研究中移动。病人的功能能力差异很大。例如,在走动的病人中,NSAA基线范围从5到34分。26的FVC高于80%的34个病人。两名患者在夜间通气支持。
协会生物标志物与年龄和互相关在生物标记
国际刑事法庭的Cr / Crn和肌肉生长抑制素既高0.960 (图1 a和B),这表明这两个标记的值强烈病人具体和高度异构的病人。与年龄相关的生物标记物都不是(调整p值= 0.626和0.147,分别)。CK是缺乏耐心具体(ICC = 0.550,图1 c),随着年龄的增长而下降(调整p= 0.0002)。估计混合模型对所有生物标志物eTable 1中概述(links.lww.com/WNL/C505)。Cr / Crn和肌肉生长抑制素的值高度相互关联(ρ=−0.85,调整p< 0.001,图2一个与CK)和显示低相关性(调整p= 0.362,p分别为= 0.034,图2 b和C)。
肌酸和肌酐比(A)、肌肉生长抑制素(B)和肌酸激酶(C),肌酸和肌酐比和肌肉生长抑制素是高度病人具体。随着时间的推移只有肌酸激酶显著下降(调整p= 0.002)。BMD =贝克尔肌肉萎缩症;Cr / Crn =肌酸/肌酐比;CK =肌酸激酶。
生物标志物的相关性与疾病严重程度、疾病进展,抗肌萎缩蛋白百分比
ambulant患者、NSAA TMRv 6 mwt显示与Cr / Crn强负相关性(ρ<−0.80,调整p< 0.001,图3 a和CeFigure 1,links.lww.com/WNL/C505与肌肉生长抑制素)和强烈的正相关性(ρ> 0.79,调整p< 0.001,图3 b和D和eFigure 1)。随着NSAA也表现在患者失去了移动在研究过程中,我们也相关的生物标志物NSAA数十只走动的病人。Cr / Crn和肌肉生长抑制素与NSAA仍高度相关(ρ=−0.83和ρ= 0.85,分别调整p< 0.001)。功能测试没有与CK(ρ≤0.25,调整p> 0.33,eFigure 1)。适度与Cr / FVC相关Crn(ρ=−0.45,调整p= 0.02),肌肉生长抑制素(ρ= 0.58,调整p= 0.001)和CK(ρ= 0.55,调整p= 0.003)。
动态评估随机拦截的北极星(A, B)和10米运行速度(C, D)相关高度随机拦截的肌酸/肌酐比和肌肉生长抑制素。Cr / Crn =肌酸/肌酐比;NSAA =北极星动态评估;TMRv = 10米的速度运行。
Cr / Crn和肌肉生长抑制素相关的适度的年平均变化6 mwt(ρ=−0.53,调整p= 0.02和ρ= 0.56,调整p分别为= 0.016,图4a - c)。所有其他3生物标志物之间的相关性和功能测试的平均每年改变和肺功能很弱(−0.27 <ρ< 0.10,调整p> 0.39,eFigure 2 -ⅰlinks.lww.com/WNL/C505)。没有3生物标志物与肌肉的肌营养不良蛋白水平,量化TA肌肉(ρ< 0.17、eFigure 3 a - c)。
预测的并发使用年龄、功能性能生物标志物,肌营养不良蛋白百分比
解释方差的并发性能,因为评估由NSAA TMRv,和6 mwt,使用每个单独预测最高使用肌肉生长抑制素(bootstrap-corrected R2=∼50%)和肌酸酐/肌酐比(bootstrap-corrected R2= 55% - -60%)(图5)。结合年龄和这两个生物标记解释方差增加约75%。肌营养不良蛋白比例似乎没有改善预测,虽然只有20个病人的肌营养不良蛋白的数据可用。并发肺功能(FVC %)可以预测肌酸酐/肌酐35%左右比肌肉生长抑制素的10%,30%的生物标志物结合年龄(数据未显示)。
讨论
在这个未来四年的研究中,我们旨在调查是否Cr / Crn,肌肉生长抑制素,CK可以是疾病严重程度和发展弹道导弹防御的生物标志物。Cr / Crn和肌肉生长抑制素,但不是CK,病人非常具体和与疾病严重程度与疾病进展但不超过4年。并发功能性能的变化解释说,这些生物标记物与年龄是高达75%。我们的研究表明,Cr / Crn和肌肉生长抑制素可能候选人在BMD监测生物标志物。
缺乏结果措施能够显示变化的持续时间内罕见的审判和缓慢进行性疾病阻碍了开发和评估潜在的药物在临床试验中。监测生物标记已经被美国食品和药物管理局定义测量随着时间的推移,作为生物标志物。29日一般监测生物标志物可能用于多种目的,包括检测治疗效果或疾病进展或决定如何代谢药物。因此,这个术语涵盖了几种类型的生物标记物,包括预测、预测响应(药效),和安全的生物标志物。肌酸肌酸中使用/肌酐比来自饮食,但也可以使用guanidinoacetic酸和S-adenosyl-methionine肝脏中合成。它的功能作为一个能源缓冲高能要求组织如骨骼肌肉组织。在较低的时期,肌肉活动,肌酸是磷酸化创建转移的磷酸肌酸磷酸基三磷酸腺苷(ATP)肌酸。这个可逆转移催化CK和收益率二磷酸腺苷(ADP)和磷酸基。在高能肌肉细胞的需求,磷酸肌酸磷组转移从创建ATP和ADP可以在几秒内发生强烈的肌肉工作。30.肌酸是nonenzymatically转化为肌酸酐在人类肌肉组织在一个恒定速率约1.7%的每天,然后释放到血液和肾脏清除。31日与损失是典型的肌肉肌肉营养不良,更少的肌酸转化成肌酸酐,导致肌酸与肌酐比率增加。血清肌酐已被证明是减少在一些神经肌肉疾病,包括demand media, BMD,脊髓性肌萎缩。14,15,32,- - - - - -,34两个研究群体的主要儿科dystrophinopathy证明肌酐水平杰出DMD患者BMD,而且它与功能呈负相关;肌酐也在一个较小的纵子集与疾病进展恶化DMD (n = 32)和BMD (n = 4)患者中,有2个时间点跨越多个年。32,33肌肉生长抑制素(或生长分化因子8)转化生长因子β家族的一员,作为肌肉生长抑制剂。35生产和发布的驻留在骨骼肌组织细胞和成纤维细胞。36肌肉生长抑制素循环血液中以潜在的形式作为一个复杂的2 c端二聚体和2氨基端抑制prodomains。prodomains裂解时,肌肉生长抑制素二聚体变得活跃和复杂可以绑定到其受体激活素受体IIB型(ActRIIB)和激活素受体激酶(碱性)4或ALK5 1型受体在肌肉组织。在绑定,肌肉生长抑制素抑制肌肉生长在三种不同的途径;肌细胞生成是通过增殖作用表达下调的蛋白激酶激活和通过Smad 2/3磷酸化和随后的核易位,和蛋白质合成减少哺乳动物雷帕霉素靶信号的抑制。37抑制肌肉生长抑制素的途径已被证明导致小鼠肌肉肥大模型各种肌肉营养不良。38,- - - - - -,41循环似乎肌肉生长抑制素水平较低的患者临床上较严重疾病如DMD和SMA与BMD和facioscapulohumeral肌肉萎缩症。16,17此外,它的水平似乎DMD患者随着年龄增长而减少。的差别,对这些肌肉生长抑制素可能是由于一种内在疾病过程中患者临床上更严重的疾病,或者它可能是一个直接后果的肌肉(例如,肌肉组织的数量,能够产生肌肉生长抑制素)或两者的结合。
我们研究的结果与先前的发现在DMD,更高的Cr / Crn有关降低电动机性能测量功能的性能。15肌肉生长抑制素水平较低相关性弱与降低函数DMD患者和肢带肌萎缩症2型b。16这些结果可以复制在我们BMD队列时只考虑到基线测量肌肉生长抑制素(ρ=−0.410,p= 0.052,数据未显示),但不是因为Cr / Crn(ρ= 0.279,p= 0.177,数据未显示)。此外,肌肉生长抑制素显著低于nonambulant DMD患者BMD患者对比还能走路。16然而,考虑到疾病,比如DMD和BMD的进步性质,很难证明一个横断面研究的生物标志物和功能性能之间的关系,在年龄通常与功能下降有关。在我们的研究中,较低的Cr / Crn和更高的肌肉生长抑制素水平相关的校正年龄后更好的功能性性能,因此支持这些标记的结论与并发相关性能的影响。
尽管强大的肌肉生长抑制素的相关性和Cr / Crn和性能,我们观察到一个温和的和重要的协会之间的生物标志物,平均每年只有6 mwt下降,而相关性与NSAA TMRv是软弱和不显著。6 mwt最初是作为一种工具来衡量全球开发和综合反应所涉及的所有系统在运动过程中,如肺和心血管系统和肌肉的新陈代谢。42它的功能来衡量耐力,而瞬态峰值活动TMRv措施,NSAA是日常生活的一个重要测量活动。虽然生物标志物如Cr / Crn和肌肉生长抑制素耐力多年来反映变化,而不是改变瞬态峰值活动或日常生活活动,可能是缺乏明确的功能下降的一部分病人在任何功能测试在我们的研究中(在准备手稿)研究了4年来不允许在性能测试来识别这些变化。特别是功能尺度,如NSAA、地板和天花板效应观察,因此屏蔽每年检测功能变化的可能性,因此生物标志物的相关性。
并发功能性能的预测更准确的使用肌肉生长抑制素和Cr / Crn一起随着年龄而单一预测时使用。这些并发功能的预测的结果与先前的研究中几个预后预测模型对未来的变化函数是为了优化试验设计模式。这些模型包括23305 1137患者观察和报告更准确预测未来变化的功能性能使用多个预测而不是一个预测。未来表现的解释方差50% -60%使用结合临床等因素动态功能和使用类固醇的多种措施。43,- - - - - -,45尽管小数量的个人和观察,我们的模型导致预测精度很高,表明添加肌酸,肌酸酐,肌肉生长抑制素导致的改善性能预测的准确性。此外,没有添加剂的抗肌萎缩蛋白的预测精度符合先前的研究从我们组和其他证明肌营养不良蛋白比例与功能性能相关性有限,尽管中可用的抗肌萎缩蛋白比例只有大约一半的患者BMD在我们的研究中。24,46在52岁患者的另一个研究中,抗肌萎缩蛋白表现出温和的正相关性与几个功能的措施。47
应该承认一些局限性。撤军的血液是变量之间以及患者在研究过程中,发生之前或之后的临床评估。我们只包括ambulant评估分析。肌营养不良蛋白只提供横向比较的一个子集的病人。这可能会影响预测的准确性的并发性能。我们不能控制这个研究饮食/补充摄入量和身体精益质量。这可能影响总生物标志物水平,应该在未来的研究调查。虽然我们的研究包括纵向血清样本和临床数据需要识别潜在的监测生物标记,提出数据显示微小的变化随着时间的推移对Cr / Crn和肌肉生长抑制素和功能。这个目前限制可能更紧密地定义的上下文使用这些物质。
总之,Cr / Crn和肌肉生长抑制素可能用作监测生物标志物在弹道导弹防御,因为更高的Cr / Crn和更低的肌肉生长抑制素与病人的相关性能校正年龄后,他们改进并发功能的预测性能与时代相结合。更长的随访,增加样本大小和/或关注患者需要更多的类似功能下降的速度来获得更多的纵向关系的洞察力Cr / Crn和肌肉生长抑制素的功能和疾病的里程碑BMD澄清他们的潜能作为监测生物标志物。此外,血清生物标志物之间的相关性和定量核磁共振措施应该调查,因为它已被证明,肌肉MRI也可以使用作为疾病进展的生物标志物在DMD和BMD。48,49
研究资金
研究由格兰特113302001来自荷兰卫生研究与发展组织(海牙,荷兰)和左Spieren为Spieren(批准号SvS15)。生物标志物的分析是由固体生物科学公司。
信息披露
z . Koeks, n·m·范·德·m·Signorelli n . Verwey m . Overzier和j报告他没有相关的披露;g . Sajeev和j . Signorovitch分析集团的员工,一个咨询公司,收到了坚实的生物科学的资助,支持本研究;诉Ricotti DiNAQOR AG)的创始人之一;J.J.G.M. Verschuuren报告没有披露有关;kj布朗是一个员工和股东的固体生物科学公司;p . Spitali担任科学顾问阿斯特拉,BioClinica BV, Epirium, EspeRare,马拉松,PTC, Sarepta,固体生物,峰会疗法PLC, D-RSC财团。补偿都是由LUMC接收。没有收到个人经济利益;再见尼克是一个网站BioMarin进行的临床试验的主要负责人,葛兰素史克,礼来,Santhera制药、Italfarmaco SpA,罗氏制药,ReveraGen, NS制药,FibroGen, Alexion Argenx,在提交工作。他也为BioMarin咨询公司报道,峰会,PTC疗法,生命科学,胡搅蛮缠,詹森,RegenxBio Epirium生物。 All reimbursements were received by the LUMC. No personal financial benefits were received. Go to半岛投注体育官网Neurology.org/N为充分披露。
承认
作者感谢所有的患者参与了这项研究。
附录的作者
脚注
去半岛投注体育官网Neurology.org/N为充分披露。资金信息和披露认为作者相关的,如果有的话,年底提供这篇文章。
这篇文章加工费由莱顿大学医学中心资助。
↵*这些作者的贡献同样文章的第二作者。
提交和外部同行评议。处理编辑器是蕾妮Shellhaas医学博士,女士。
- 收到了2022年1月26日。
- 接受的最终形式2022年10月11日。
- 版权©2022年作者(年代)。发表的Wolters Kluwer健康,公司代表美国神经病学学会。半岛投注体育官网
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