摘要
背景:针对水通道蛋白-4星形细胞水通道的自身抗体仅限于视神经脊髓炎(NMO)和相关中枢神经系统炎症性脱髓鞘疾病(复发性视神经炎和纵向广泛的横切性脊髓炎)患者的血清和脑脊液。nmo典型病变不同于ms典型病变。水通道蛋白-4选择性地在水肿/炎症的血管中心部位丢失，与免疫球蛋白(Ig) G、M和终末补体产物的局灶性沉积一致，伴髓磷脂丢失或不伴髓磷脂丢失。缺乏抗原特异性自身抗体致病性的证据。
方法:我们使用共聚焦显微镜和流式细胞术来评估Ig与表达水通道蛋白-4的活靶细胞表面表位结合的选择性和免疫病理后果，水通道蛋白-4在其细胞质n端与GFP融合。我们检测了NMO患者、神经对照患者和健康受试者的血清、igg富集和igg缺失的血清组分以及CSF。我们还分析了有髓鞘的成年小鼠视神经和脊髓中的水通道蛋白-4免疫反应性，以及NMO患者存档脑组织中的浆细胞Ig同种型。
结果:NMO患者血清IgG与水通道蛋白-4胞外结构域结合;主要是IgG1它启动了两个潜在的竞争结果，水通道蛋白-4的内吞/降解和补体激活。血清和脑脊液缺乏水通道蛋白-4特异性IgM, NMO中枢神经系统病变的浆细胞仅含有IgG。副神经节星形细胞终足高表达水通道蛋白-4。
结论:NMO患者血清IgG对表达水通道蛋白-4的细胞膜具有选择性病理作用。IgG靶向Ranvier淋巴结周围星形细胞过程可引发脱髓鞘。
术语表
- AQP4＝
- aquaporin-4;
- 绿色荧光蛋白＝
- 绿色荧光蛋白;
- HEK293＝
- 人类胚胎肾细胞系;
- 女士＝
- 多发性硬化症;
- 动＝
- neuromyelitis视。
中枢神经系统(CNS)的炎症性脱髓鞘疾病是年轻人非创伤性神经功能障碍的主要原因，并且被认为是免疫介导的。最常见的临床诊断是多发性硬化症(MS)，缺乏特定的生物标志物。我们最近定义了一种自身抗体标记物，专门用于视神经脊髓炎(NMO，也称为光脊髓性多发性硬化症)和相关疾病。NMO-IgG是任何形式的特发性中枢神经系统脱髓鞘疾病的第一个自身抗体标记物。它选择性地结合水通道蛋白-4 (AQP4)，这是中枢神经系统中最丰富的水通道。1 - 5AQP4不是髓磷脂或少突胶质细胞的成分，而是一种完整的同四聚体蛋白，在与中枢神经系统微血管、室管膜和神经元间突触连接相关的星形细胞终足的极化质膜中高度表达。AQP4调节血脑及伴K的脑脊髓液之间的双向水通量+离子通量。6、7
检测NMO- igg可以区分NMO和复发缓解型MS，两者经常被混淆。1、3 - 5、8NMO传统上被认为是选择性地累及脊髓(通常是纵向广泛的病变)和视神经，8严重的临床发病率，以及影响灰质和白质的破坏性免疫病理病变。9临床和病理观察支持AQP4特异性自身抗体在NMO中的致病作用:1)急性NMO患者对抗体消耗治疗反应良好10、11;2)脑室周围的MRI病变，这是典型的NMO;12定位于AQP4高表达位点13;3) NMO中枢神经系统病变表现为AQP4免疫反应性丧失14、15;4) NMO的中枢神经系统病变表现出免疫球蛋白(IgM和IgG)和补体活化产物以血管为中心的沉积模式，与AQP4的正态分布一致。9、15
本报告阐述了AQP4作为疾病特异性抗原而引起的NMO发病机制的三个问题21)免疫球蛋白与靶细胞膜AQP4相互作用的免疫生物学结果如何?2)哪些类型的aqp4特异性igg具有致病性?3)如果NMO是一种针对星形胶质细胞的自身免疫性水通道病变，那么髓磷脂(少突胶质细胞产物)的损失是什么原因?
方法
细胞系和转基因构建物。
正常成人切片中NMO-IgG(和亲和纯化的aqp4特异性兔IgG)的主要结合位点15和鼠标1、2中枢神经系统组织是AQP4表达密度最高的地方，即星形细胞足突高极化质膜的三磷酸腺苷复合物。7由于AQP4在这些位置的超微结构排列紧密，因此在免疫组织化学上很容易观察到这些位置。16在初步的Western blot研究中(蛋白超载条件下)，我们观察到大鼠少突胶质星形细胞祖细胞系(CG4)，17当体外分化为星形细胞表型(星形和表达突出的细胞质GFAP中间丝)时，表达最小的AQP4免疫反应性，并且两种独立的人星形细胞瘤细胞系(HTB-14和CRL-1718;通过免疫荧光或Western blot均未检测到AQP4的表达。因此，作为体外研究IgG与AQP4细胞外表位相互作用的免疫生物学后果的初始系统，我们选择使用我们之前描述的转染人胚胎肾细胞系(HEK293)过表达全长人AQP4蛋白(在其n端与绿色荧光蛋白[GFP]融合)。2亲本HEK293细胞系不组成性地表达AQP4，但表达AQP4的糖障碍复合物伴侣蛋白，确保AQP4在质膜上的稳定插入。2此外，转染细胞膜中相邻AQP4同型四聚体的接近性模拟了高度极化星形细胞足过程中表位的紧密堆积。16(见补体激活结果章节讨论使用aqp4转染的HEK293细胞作为底物的其他实际优势。)
抗体和血清。
荧光染料偶联的山羊IgG购自Molecular Probes公司(Alex-Fluor 546):人、小鼠或兔IgG特异性;和Oregon Green:小鼠IgG特异性)或Invitrogen (Cy5;兔IgG特异性)。偶联单克隆小鼠IgG (FITC):人IgG亚类特异性;或Cy3:胶质纤维酸性蛋白和钠通道特异性)来自Sigma，未偶联的igg来自BD Biosciences (Caspr1和早期内核体抗原-1 [EEA1])和丹麦Dako(人CD138)。山羊IgG单特异性人IgG (TRITC偶联)或人IgM (FITC偶联)来自南方生物技术公司。兔IgG特异性AQP4残基249-323来自Sigma。人C9neo特异性兔IgG是英国卡迪夫Paul Morgan博士赠送的。未鉴定患者的血清来自明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所检验医学和病理学部神经免疫学实验室。
疣状。
所有活细胞的最终制备，以及小鼠组织切片和尸体解剖的人淋巴结和脑组织切片，都被安装在延长金DAPI抗褪色培养基(分子探针)中。荧光图像由蔡司LSM510共聚焦显微镜捕获。免疫过氧化物酶染色的切片用苏木精反染，用Olympus DP-BSW显微镜和DP70数码相机系统拍照。
活细胞依次暴露于稀释1:1000的20%人血清或兔抗aqp4 IgG和1:50 00的二抗中，95%乙醇/5%醋酸冷冻15分钟。固定在10%福尔马林中的细胞被渗透、阻断，并在一抗和二抗探针中孵育。经灌注的小鼠解剖组织在4%多聚甲醛中放置过夜，在30%蔗糖中放置24小时，在OCT培养基中冷冻，切片(8 μm)，风干，在含有0.1% triton X-100的10%正常山羊血清中依次孵育(30分钟)，一抗(18小时)，二抗(1小时);室温)。解剖后的人淋巴结和脑组织，用10%福尔马林固定，石蜡包埋，去蜡，切片(5 μm)，用蒸馏水冲洗，蒸汽加热。切片用10%正常山羊血清孵育1小时，然后用一抗(抗cd138, 1:50;抗igg: 1:50 0;抗igm为1:200)。
抗原调节试验。
在56°C下保持30分钟，使患者和对照组血清中的补体失活。活细胞的延时显微照片每隔15分钟拍摄24小时。16小时后，将含人血清的培养基替换为含或不含环己亚胺(0.25 μg/mL)的新鲜培养基。将检测血清加入培养基中，在37℃下放置16小时，或在4℃下放置1小时。细胞洗涤，用Alexa-Fluor 546标记的抗人IgG(1:500)暴露30分钟，再次洗涤，冷冻95%乙醇/5%乙酸固定，PBS冲洗，Hoescht (1 μg/mL)染色。
补体活化试验。
GFP-AQP4-HEK293细胞与20%热灭活对照或NMO患者血清在冰上孵育2小时。用冷冻DMEM培养基洗涤细胞，并在37℃下暴露于20%新鲜(或热灭活)正常人血清(作为补体源)45分钟。冲洗固定(10%福尔马林，4分钟)后，细胞在室温下依次用0.1% 3-[(3-胆酰胺丙基)二甲胺]-1-丙磺酸(1分钟)、10%正常山羊血清和兔抗人C9neo抗体(30分钟)孵育，水洗后用标记的兔抗IgG孵育。为了评估补体对膜完整性的影响，在4°C(1小时)下向细胞中加入人血清测试池。在37°C(95%空气/5% CO)条件下孵育90分钟后2)在新鲜或热灭活的low - ox- h兔补体中(雪松实验室;20%终浓度)，通过透射光场成像检查单层膜并拍照。在连续暴露于血清(室温下30分钟)和补体(37°C下30分钟)后，通过流式细胞术分析定量补体介导的膜溶解活性，用胰蛋白酶将细胞提起，洗涤，悬浮在冷冻缓冲液(10 mM Hepes/NaOH, pH 7.4;140 mM NaCl;2.5 mM CaCl2)，含0.5 μg碘化丙啶(BD Biosciences)，在黑暗中保存15分钟后进行分析。通过比较碘化丙啶通透性gfp阳性细胞与碘化丙啶通透性gfp阴性细胞的百分比来确定膜通透性的增加。在补体缺乏抗原特异性激活的情况下，膜通透性的增加不到1.25倍(125%)。
IgG的消耗和纯化。
用蛋白g -琼脂糖珠从血清池中去除IgG(在4°C下2小时)。补体试验中使用浓度为20%的igg -贫血清。用0.1 M醋酸洗涤蛋白G珠洗脱IgG，用PBS进行中和，用Centricon M-3过滤装置(Millipore)进行浓缩。用速率比浊法测定IgG浓度。
延时显微照片。
将GFP-AQP4-HEK293细胞接种到光学质量玻璃底板(MatTek)上，暴露于20%对照或NMO患者血清中(见视频E-1)半岛投注体育官网®网址:www.半岛投注体育官网neurology.org）.每隔15分钟，使用蔡司LSM510显微镜，在95%空气/5% CO中，37°C的条件下，捕捉活细胞的延时显微照片，持续6小时2．对每个时间点进行Z系列成像并转换成视频。
结果
NMO-IgG启动AQP4的内溶酶体降解。
IgG发挥器官特异性致病性的一个先决条件是它能够与活靶细胞表面可接近的特异性表位结合。当我们将表达表面AQP4的转染靶细胞暴露在NMO患者血清池中(在4°C下限制膜流动性)时，IgG以线性模式与GFP-AQP4共定位(图1一个）.来自对照患者的血清IgG不能与细胞表面结合，而针对AQP4细胞质表位的特异性IgG不能与细胞表面结合，除非质膜被渗透。NMO患者血清IgG不与载体转染的对照HEK293细胞结合(数据未显示)。因此，NMO患者的IgG特异性结合AQP4的胞外结构域。
图1IgG(红色)与AQP4的胞外结构域结合，启动AQP4表面的下调(通过细胞质n端融合的绿色荧光蛋白[GFP]可见)
(A)对照血清IgG不结合。兔IgG特异于细胞质AQP4表位(c末端残基249-323)，仅与渗透细胞结合。NMO患者血清中的IgG在活细胞(即细胞外表位)和通透化细胞(细胞外和细胞质表位)上与表面AQP4共定位。DNA用DAPI染色(蓝色)。(B)在4°C时，NMO患者血清IgG与表面AQP4呈线性共定位。37°C孵育过夜后，细胞表面未检测到IgG和AQP4。对照血清IgG在两种温度下均不结合。比例尺代表10 μm。
为了评估该IgG对质膜AQP4的影响，我们记录了在37℃下暴露于患者血清后GFP-AQP4的分布。对照人血清对GFP-AQP4无影响，但NMO患者血清中含有aqp4特异性IgG可导致GFP-AQP4从质膜上迅速消失(图1 b和视频E-1)。该现象的温度依赖性(图1 b)与二价IgG通过分子间交联调节表面抗原一致。18在缺乏AQP4-IgG的血清中，活细胞在37°C下放置16小时的连续共聚焦图像与未处理细胞的图像在GFP-AQP4荧光强度和定位方面没有区别(图2一个）.暴露于NMO患者血清中的细胞在5分钟内发生了惊人的重新分布。AQP4的同四聚体结构，在细胞外区域具有多个重复的表位，以及单个AQP4同四聚体的邻近性，为抗原特异性IgG从质膜上快速清除表面提供了最佳靶点。质膜褪色并伴有质下细胞质绿色荧光囊泡积聚。20分钟后，GFP-AQP4呈环状聚集。在5小时时，当不再检测到质膜荧光时，这些已合并成大的细胞质聚集体。在16小时去除患者的血清导致GFP-AQP4在质下囊泡中快速重现，可能是从内质网(图2 b）.4小时时，在质膜上可见GFP-AQP4, 12小时时达到正常表面密度。取血时加入环己亚胺，观察12小时，质膜上未见GFP-AQP4。这意味着自身抗体作用的“逆转”依赖于新蛋白质的合成。
图2IgG结合表面AQP4启动快速、可逆的下调
(A)转染的HEK293细胞暴露于NMO或对照患者血清12小时(37°C)时GFP-AQP4的延时成像。表面AQP4在NMO患者血清中迅速丢失，而在对照血清中没有。随着表面AQP4的缺失，细胞质中出现小泡状结构并迅速融合。(B)去除NMO患者血清后，表面AQP4的恢复需要新的蛋白合成。在不含环己亚胺的情况下，观察到大量的小泡反映了新合成的AQP4正在转运到质膜上进行插入。在环己亚胺存在下，胞质荧光残余灶逐渐消失，反映了持续降解。(C) NMO患者血清中IgG与表面AQP4结合触发内吞作用，并将AQP4靶向至内溶酶体途径。在未经处理的细胞中，早期内体小泡(通过红色EEA1免疫反应性可识别)不与AQP4共定位。加入NMO患者血清30分钟内，几个EEA1灶与含有AQP4的细胞质囊泡重合(合并图中黄色;放大面板中的白色箭头)。 Scale bars represent 10 μm.
我们通过探测一种早期内体抗原特异性抗体，跟踪了暴露于NMO患者血清后GFP-AQP4从质膜上清除的命运。在没有血清的情况下，早期内体囊泡(红色)没有与GFP-AQP4共定位(图2 c）.然而，暴露于NMO患者血清30分钟后，早期内体囊泡获得绿色荧光(图2 c）.当细胞暴露于对照血清2小时时，早期内体囊泡未获得绿色荧光(数据未显示)。这些结果表明，胞吞作用是由IgG在细胞表面与AQP4交联而引发的，将AQP4靶向到内溶酶体途径进行降解。
NMO-IgG启动补体活化。
经典补体级联的激活是自身抗体结合AQP4的另一个潜在的致病结果。这一机制会增加微血管内皮的通透性，促进炎症细胞浸润，并可能在富含AQP4的中枢神经系统区域对星形细胞终足造成局灶性损伤。我们首先用间接免疫荧光法评价转染细胞的表面膜沉积C9neo由多个类似穿孔蛋白的C9分子在组装补体的末端膜攻击复合体时聚合产生的表位。9、19、20在NMO患者血清和活跃的人类补体存在的情况下，C9neo在表达AQP4的HEK293细胞的质膜中清晰可见(图3一(箭头)，但在缺乏疾病特异性血清或存在失活的人类补体，或转染了GFP载体的对照细胞(数据未显示)中不存在。这些数据表明，NMO患者的血清中含有一种能够激活补体级联的aqp4特异性抗体。人类IgG亚类特异性试剂显示，在所有nmo -IgG阳性患者中，aqp4特异性血清IgG均为IgG1它是人体内主要的补体激活IgG亚型(图3 b）.
图3补体的膜溶性攻击复合物在IgG与AQP4表面结合后组装
(A)转染福尔马林固定aqp4的HEK293细胞暴露于有活性或无活性补体(C ')存在的对照人血清或NMO患者血清中。终端C9的质膜结合neo成分(箭头)需要NMO患者血清和活性补体。(B)使用荧光素偶联亚型特异性抗人IgG探针(分别为γ1、γ2、γ3和γ4重链特异性)在小鼠脑切片上检测IgG亚型。只有免疫球蛋白1(5名NMO患者血清中的5名，以及代表另外10名血清阳性患者的血清池)。这种主要补体激活人IgG亚类的产生反映了促炎辅助t细胞免疫反应。其血管中心结合模式与富含aqp4的位点一致。2IgG亚类特异性试剂的特异性和最佳稀释度是用人类骨髓瘤IgG涂片确认的，涂片由梅奥诊所的Robert Kyle博士提供。一名患者血清中含有IgG3.抗核抗体(未显示)。比例尺代表10 μm。(C)暴露于对照或NMO患者血清中的活细胞。在存在AQP4特异性IgG和活性补体的情况下(37℃下1.5小时)，表达AQP4的细胞(绿色)被选择性地从单层中分离出来，箭头表示(透射的亮场图像)。
初步实验表明，为了评估NMO-IgG在高密度表达AQP4的活细胞膜上激活抗原特异性补体的功能证据，必须严格控制膜裂解条件。GFP-AQP4转染的靶细胞系是gfp阳性(AQP4+)和gfp阴性(AQP4−)细胞的混合群体(图3 c）.在对照人血清存在的情况下，相显微镜显示健康的AQP4+和AQP4−细胞在贴壁单层中。当我们将靶细胞预先暴露于特定疾病患者的血清中(冰上2小时)，然后在37°C下添加补体90分钟(用于C9的条件)neo可见)，所有绿色细胞迅速分解。因此，我们使用标准的商业兔补体制剂，在有限的浓度下，我们将细胞预先暴露于患者或对照血清中，在4°C下仅1小时，然后添加新鲜或热灭活补体。在NMO患者血清存在的情况下，明显表达GFP的贴壁细胞选择性丢失。如果补体活跃且存在超过30分钟，大多数AQP4+细胞呈圆形和漂浮状(图3 c）.无论补体活性如何，对照人血清对两种粘附人群均无明显影响。因此，NMO患者血清的细胞溶解活性取决于补体活性和靶细胞中AQP4的表达。
利用流式细胞分析(通过对红色染料碘化丙啶的渗透性)定量补体对靶细胞膜的损伤，需要进一步衰减补体的激活。因此，我们在室温下将细胞预先暴露于患者(或对照)血清中仅30分钟(而不是在4°C下1小时)，以便在添加补体之前通过抗原调节来降低AQP4抗原密度。然后与补体在37°C下孵育仅30分钟，然后收获用于分析绿色和红色荧光强度。在对照患者血清存在的情况下，暴露于活性补体或非活性补体对AQP4+或AQP4−细胞均无影响(图4、A、B）.无论靶细胞中AQP4的表达如何，补体失活时NMO患者血清对膜完整性没有影响。然而，与活性补体相比，AQP4+细胞的膜通透性平均增加5.6倍(560%)(图4 b）.因此，NMO患者血清的细胞毒性取决于AQP4的表面表达和活性补体的可用性。
图4NMO患者自身抗体诱导膜溶解病变是补体依赖性的，AQP4特异性的，并由IgG介导
(A)表达AQP4的HEK293细胞(括号内)与不表达AQP4的HEK293细胞的膜通透性增加的比较。流式细胞分析:GFP, x轴;碘化丙啶强度，y轴。NMO患者的血清和活性补体(阴影象限)的膜通透性增加4.76倍(即476%)，而对照组患者的血清或无人血清的膜通透性增加不到一倍。(B) NMO血清和活性补体诱导的膜细胞毒性定量(37℃下30分钟)。结果是7个独立实验的平均值，每个实验使用10到15个不同的NMO患者或大约350个有各种疾病的对照患者的血清池。(C)补体依赖性、aqp4特异性细胞毒性是IgG固有的，而不是IgM固有的。检测5组患者血清aqp4特异性IgM的功能证据。4个池AQP4 IgG阳性(免疫荧光法)1和免疫沉淀反应2)，一个是阴性的。每一池含有4至5名患者的血清。使用全血清(红色)、IgG-贫血清(蓝色)或纯化IgG(绿色)测量膜通透性的增加。(D)尸检NMO患者脑室下炎性病变的浆细胞中含有IgG，但不含IgM。(左)免疫过氧化物酶染色:分化，水肿组织含有cd138阳性浆细胞(箭头);e室管膜。(中)双免疫荧光染色:髓质病变含有IgG+浆细胞(TRITC;红色);IgM+浆细胞(FITC);绿色)未在任何中枢神经系统病变中发现，但室管膜下的免疫复合物沉积有微弱的IgM+。(右)对照人淋巴结组织中IgG+(红色)和IgM+(绿色)浆细胞的等量染色。比例尺代表50 μm。
aqp4特异性自身抗体不是IgM类。
以血管为中心的IgG、IgM和补体沉积是NMO患者中枢神经系统组织中发现的组织病理学病变的标志。9日,14日,15日由于五聚体IgM具有五个Fc效应域，它比IgG(单个Fc结构域)更有效地激活补体级联。因此，我们分析了NMO患者的血清和CSF中aqp4特异性IgM。通过间接免疫荧光评价富aqp4小鼠组织切片，131例NMO患者的血清或28例NMO患者的脑脊液标本均未检测到aqp4特异性IgM(数据未显示)。我们使用流式细胞术检测在临床免疫荧光评价过程中AQP4 IgG类抗体阳性或阴性患者血清中补体活化、AQP4特异性IgM的功能证据。1只有AQP4 igg阳性血清(池1-4)对AQP4+细胞有细胞毒性。当IgG耗尽时，这种细胞毒活性丧失(图4 c）.IgG从原始阳性血清池中恢复aqp4特异性补体活化的回收率与g -琼脂糖蛋白珠中IgG总回收率的百分比成正比(图4 c）.
为了确定NMO患者炎症性中枢神经系统病变中IgG和IgM产生的频率，我们研究了分化浆细胞的积累15使用荧光染料偶联的抗人IgG和IgM类特异性试剂，以限制稀释度，以避免背景细胞外IgG和IgM的干扰。9图示患者的髓质病变(图4 d(左)含有丰富的cd138阳性浆细胞，并且位于通常富含AQP4的区域。15髓质病变浆细胞中可见明亮的胞浆IgG，但浆细胞中未检出胞浆IgM (图4 d、中)。我们在人淋巴结组织的对照切片上证实了我们的检测抗体试剂的免疫球蛋白类特异性。成群的浆细胞表现出明亮的胞质IgG，而分散的浆细胞表现出明亮的胞质IgM (图4 d,对吧);很少有细胞被双重标记(未显示)。综上所述，这些数据表明IgM与IgG和补体产物沉积在NMO患者中枢神经系统组织中富含aqp4的区域9日,14日,15日不是AQP4特异性的。
脊髓和视神经Ranvier淋巴结周围富含aqp4的星形细胞突起。
髓磷脂在NMO病理中的参与仍需在AQP4的背景下解释。冻裂研究在20世纪70年代初定义粒子集合在Ranvier节点周围轴突周围的星形细胞终足的超微结构特征。21这些组合对应于最近在转染细胞中由AQP4同型四聚体形成的正交阵列。16我们通过共聚焦荧光显微镜检查小鼠脊髓和视神经组织切片，分析了星形细胞膜中aqp4特异性免疫反应性与Ranvier淋巴结的接近性。我们使用免疫兔IgG(亲和纯化的AQP4肽)而不是NMO患者的血清，因为后者是多种自身抗体的复杂混合物8日,22日并且不适合亲和纯化，因为它只与天然AQP4结合，而不与变性的、膜提取的AQP4或合成的AQP4多肽结合(V.A. Lennon和T.J. Kryzer，未发表的观察结果)。通过同时免疫染色钠通道定位AQP4在淋巴结区域;23它们密集地集中在节轴突膜上(或称为Caspr1，一种丰富的副节蛋白)24)和胶质原纤维酸性蛋白(胶质原纤维酸性蛋白，胶质原纤维酸性蛋白是星形胶质细胞过程中的胞质中间纤维)。25在脊髓和视神经中，AQP4的免疫反应性在星形细胞元件和表达钠通道免疫反应性的周期性轴突段附近强烈(图5一个）.同心圆旁腺AQP4免疫反应性比中枢神经系统白质星形细胞AQP4特征的背景网状图更亮1并且缺乏星形细胞足突所缺乏的GFAP。15如图所示图5一个在含有钠离子通道的轴突段区域，星形细胞突起周围的细胞外空间增大。23强烈的AQP4和Caspr1免疫反应并置(图5 b)与星形细胞足突延伸至Ranvier结外的旁阳面一致。
讨论
我们的结果支持aqp4特异性IgG(主要是IgG)的作用1)，而不是IgM，作为CNS炎症性疾病患者的病理生理效应者。在我们的临床经验中，发现NMO-IgG局限于脑脊液的情况并不常见。这一观察结果，以及NMO患者脑脊液中寡克隆IgG条带的罕见性(与MS相比)，8提示致病性NMO-IgG是在外周淋巴组织而非中枢神经系统室合成的。如果这种IgG接触星形胶质细胞终足，即使是少量的，我们证明其与AQP4细胞外结构域结合后的结果可能会影响星形胶质细胞极性，损害终足膜完整性、渗透调节、血脑屏障功能以及副神经和突触微环境的维持。IgG结合诱导的表面AQP4的快速内吞和降解提示了NMO患者中枢神经系统组织中最近发现的两种生理底物:1)免疫组织化学观察到AQP4的丢失，在推测的早期炎症性病变中，但缺乏脱髓鞘;152)在脑脊液后区和其他AQP4高表达的心室周围区域观察到可逆性、nmo典型的放射学病变。13我们的研究表明，在细胞外环境中去除NMO-IgG后，新合成的AQP4快速补充质膜，至少在疾病过程的早期阶段，支持了可逆损伤的可能性。这一观察结果合理地解释了一些患者在早期血浆置换后神经功能损伤的迅速逆转。10
我们的体外观察预测，补体成分在IgG与AQP4相互作用位点的及时可用性(即在表面AQP4表达下调之前)将触发爆炸性炎症级联反应。抗原调节和补体激活的相对优势，代表IgG1与表面AQP4结合的竞争性后遗症，可能是个体患者临床表现、治疗反应和病程的关键决定因素。在星形细胞末端足中，IgG与AQP4的互补四聚体结合，呈现出广泛的Fc结构域阵列，这将满足满足经典补体级联所需的第一组分C1q的精确几何排列。26这种表位阵列类似于骨骼肌突触后膜中烟碱乙酰胆碱受体的紧密堆积，在重症肌无力急性被动转移实验模型中使补体爆发性激活。27星形胶质细胞可能对NMO的炎症后遗症起积极作用，因为它们产生并响应促炎细胞因子，并能产生和分泌经典补体系统和替代补体系统的所有成分。28它们自身的膜相对抵抗补体溶解，因为它们具有补体调节蛋白，28但是，不管膜溶解或髓磷脂丢失，15星形细胞足突补体级联的早期组分的激活将引发炎性白细胞的强烈浸润，这是NMO病变的特征。9日,14日,15日
在此过程中产生的补体片段可增强内皮细胞的通透性，促进血清免疫球蛋白局灶性实质内流。具有类风湿因子样结合抗原结合IgG Fc结构域能力的IgMs会放大aqp4特异性IgG靶向的星形细胞末端的炎症，从而使补体激活永久化。这一建议得到了狼疮相关患者血清IgM水平经常升高的报道的支持anti-Ro(SS-A)抗核抗体;29这在16%的NMO患者中发现。22
几种看似合理的机制可能引发NMO脱髓鞘。首先，少突胶质细胞比星形胶质细胞更容易受到有害刺激的致死性损伤。30.对产生和维持髓磷脂的少突胶质细胞的损伤可以在偏执狂直接接触含有aqp4的星形细胞足突时预测。或者，继发性脱髓鞘可能是由于节间离子微环境改变引起的轴突损伤所致。谷氨酸毒性是引发脱髓鞘的第三种潜在机制。星形胶质细胞谷氨酸转运体GLT1(也称为EAAT2)对于清除兴奋性突触中的谷氨酸至关重要，其自身的表达依赖于AQP4的表达。31因此，NMO-IgG下调星形细胞AQP4导致谷氨酸水平的局部升高，可能会杀死在其过程中表达钙通透性谷氨酸受体的少突胶质细胞。30日,32治疗性阻断AMPA受体可改善多发性硬化症动物模型的神经系统后遗症。33、34谷氨酸受体阻断在急性NMO中作为一种保护髓鞘和轴突的治疗策略，有必要进行临床试验。
鸣谢
作者感谢Denice Bredlow, Aaron Maixner以及神经免疫学实验室和Mayo流式细胞术/光学形态学核心设施的成员提供的技术支持，以及John Henley博士建议使用EEA1内溶酶体靶向IgG交联AQP4的标记。
脚注
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补充资料见www.半岛投注体育官网neurology.org
2007年10月10日，电子pub将先于印刷版面世www.半岛投注体育官网neurology.org．
这项工作得到了梅奥基金会和拉尔夫·威尔逊医学研究基金会的资助。
披露:根据1980年的Bayh-Dole法案和梅奥基金会的政策。Lennon和Lucchinetti以及Kryzer先生将获得与AQP4自身抗原相关的知识产权使用费。该知识产权授权给一家商业实体，用于开发一种简单的抗原特异性检测方法，以便在全球范围内为患者提供护理。这项测试并不是梅奥诊所所独有的。到目前为止，作者总共收到了不到1万美元的版税。梅奥诊所将该检测作为间接免疫荧光检测来帮助诊断视神经脊髓炎，但作者个人并未从该检测的表现中获益。其他作者报告没有利益冲突。
由Vanda Lennon博士于2006年4月6日在加州圣地亚哥举行的第58届美国神经学家协会年会上作“神经科学前沿”演讲。
2007年6月13日收。2007年9月4日最终定稿。
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