摘要
背景:神经元核内包涵体病(NIID)是一种进行性神经退行性疾病，其特征是神经元和体细胞中嗜酸性透明质核内包涵体。由于NIID的临床表现多样，故其生前诊断较为困难。
方法:对来自家族性NIID患者的7个皮肤活检样本进行了组织化学评估，并将结果与正常对照组和其他神经疾病患者的皮肤样本进行了比较。我们还用电子显微镜检查了NIID患者的皮肤活检样本。
结果:在NIID皮肤活检样本中，在脂肪细胞、成纤维细胞和汗腺细胞中观察到核内包涵体。用抗泛素抗体和抗sumo1抗体对这些包涵物进行染色。电镜显示，脂肪细胞、成纤维细胞和汗腺细胞的核内包体特征与神经元细胞相同。约10%的脂肪细胞显示核内包涵体。在正常对照组和其他神经系统疾病患者的皮肤样本中未发现核内包体。
结论:皮肤活检是一种有效且微创的死前诊断工具。
神经元核内包涵体病(NIID)，又称神经元核内透明质包涵体病，是一种进行性神经退行性疾病，以神经元和内脏器官细胞中嗜酸性透明质核内包涵体为特征。1，- - - - - -，4NIID的临床表现变化很大，可包括锥体和锥体外系症状、小脑性共济失调、痴呆、惊厥、神经病和自主神经功能障碍。1，- - - - - -，6散发性和家族性病例均有报道，发病时间从婴儿期到中年晚期不等。1，- - - - - -，6NIID的死前诊断是困难的，大多数报道的NIID病例是通过死后组织病理学检查诊断的。一些报道描述了死前通过直肠活检诊断NIID5，6还有腓肠神经活检。2然而，直肠活检有穿孔的风险，7腓肠神经活检仅适用于感觉障碍患者。2为了避免死前直肠或腓肠神经活检诊断NIID的困难，我们研究了家族性NIID患者的皮肤活检样本，并将其与正常对照组和其他神经退行性疾病患者的皮肤活检样本进行了比较。我们的结果表明，皮肤活检是一种有用和安全的工具，用于NIID的死前诊断。
方法
科目。
皮肤组织样本来自尸检样本，皮肤活检样本来自名古屋大学医院的患者和正常志愿者。总体而言，如我们之前报道的，来自2个谱系的7例家族性NIID患者的皮肤活检样本，2进行了分析。不包括散发NIID的患者。对于其他神经退行性疾病，3个来自Charcot-Marie-Tooth (CMT)患者的活检样本PMP222例家族性淀粉样多神经病(FAP)患者的尸检样本和1例活检样本，1例亨廷顿病(HD)患者的遗传诊断活检样本，3例脊髓小脑共济失调3 (SCA3)患者的活检样本，3例牙状库性pallidoluysian萎缩(DRPLA)患者的活检样本，2例脊髓和球性肌肉萎缩(SBMA)患者的尸检样本和1例活检样本，分析了散发性肌萎缩性侧索硬化症(ALS)患者3例尸检标本，帕金森病(PD)患者2例尸检标本和1例活检标本，多系统萎缩(MSA)患者1例尸检标本和2例活检标本，进行性核上性麻痹(PSP)患者2例尸检标本和1例活检标本，正常志愿者8例。对所有CMT、FAP、SCA3、DRPLA和SBMA患者进行基因评估。
标准方案批准，注册，病人同意。
该研究是根据名古屋大学医学院的机构审查委员会批准的方案和知情同意进行的。所有患者和正常志愿者均获得书面知情同意。
皮肤活检，免疫组织化学和电子显微镜研究。
局麻后，在外踝上方10cm处取一个直径为3毫米的穿刺活检标本。所有样品在10%的福尔马林中固定。所有样品切片(4 μm)均用苏木精和伊红(H&E)染色，并使用Ventana DISCOVERY系统(Ventana Medical Systems, Tucson, AZ)进行免疫组化分析。切片用抗泛素抗体(Z0458;DAKO, Glostrup，丹麦)和抗sumo1抗体(sc-5308;Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)使用Ventana DAB Map工具包。为了进行免疫荧光染色，切片用4%的山羊血清阻断，并在抗泛素抗体(P4D1;圣克鲁斯生物技术)。结合抗泛素抗体使用抗鼠山羊免疫球蛋白G偶联Alexa Fluor 488(分子探针，尤金，OR)。用1.5 μg/mL 4 '，6-二氨基苯吲哚二乳酸酯(DAPI)染色。 Samples for electron microscopy were fixed in glutaraldehyde in cacodylate buffer and embedded in epoxy resin.8
结果
我们进行了30多次皮肤活检，没有任何不良反应或事故。NIID患者的h&e染色切片显示真皮脂肪细胞、成纤维细胞和汗腺细胞中存在嗜酸性核内包涵体(图1a - c)。这些细胞的细胞核呈强烈的嗜碱性染色，这使得在如此小的深染细胞核中很难观察到包体(图1a - c)。在使用DAB技术的抗泛素染色切片中(图1， D-F)，在所有7个NIID样本中都很容易识别核内包体。然而，红细胞和汗腺分泌的一些物质被抗泛素抗体强烈染色，这使得这些物质与核内包涵体难以区分。
(A - C)脂肪细胞(A)、成纤维细胞(B)和汗腺细胞(C)的苏木精和伊红(H&E)染色。(D - F)脂肪细胞(D)、成纤维细胞(E)和汗腺细胞(F)的抗泛素抗体使用DAB技术进行免疫染色。(G - L)脂肪细胞(G, J)、成纤维细胞(H, K)和汗腺细胞(I, L)的电镜图像。(G - I)核内包体(箭头)的低倍镜。(J-L)每个核内包体的放大图。(M - O)采用DAB技术对脂肪细胞(M)、成纤维细胞(N)和汗腺细胞(O)进行抗sumo1抗体免疫染色。(P-T) NIID患者神经元细胞核内包涵体的组织病理学特征2:交感神经节神经元H&E染色(P);背根神经节神经元(Q)抗泛素抗体免疫染色;前角星形胶质细胞低倍镜(R)和高倍镜(S)的电镜图像;用交感神经节神经元(T)抗sumo1抗体免疫染色(A-F, M-Q, T)比例尺= 10 μm。(G-I, R)比例尺= 2.0 μm。(J-L, S)比例尺= 500 nm。
通过电子显微镜检查，脂肪细胞、成纤维细胞和汗腺细胞中的核内包涵体具有共同的特征(图1G-L)。这些包体由丝状物质组成，没有限制膜。脂肪细胞的核被观察到完全是电子密集的，但我们能够识别脂肪细胞核中的包体(图1， G和J)。成纤维细胞细胞核的电子密度低于脂肪细胞，包体很容易被识别为电子密集的球形体和以鼻甲状排列的细丝(图1， H和K)。在汗腺细胞中，核内包体作为电子轻物质存在于核内(图1， I和L)。
我们还检测了抗sumo1抗体的免疫反应性。SUMO1是一种小的泛素样修饰蛋白，与各种细胞内靶蛋白共价偶联以改变其细胞分布、功能和代谢。NIID患者的神经元核内包体对SUMO1具有免疫反应性。9真皮细胞内核内包体显示抗sumo1免疫反应性(图1， M-O)，与先前报道的NIID神经元细胞的结果相似。1，9
这些夹杂物的特征与NIID患者的神经元夹杂物相同(图1- t)。2
核内夹杂物的频率。
我们使用抗泛素抗体和DAPI研究了脂肪细胞、成纤维细胞和汗腺细胞中核内包体的频率，目的是将核内包体与其他泛素阳性材料区分开来。在合并视图下，核内包体很容易被识别为dapi阳性核内的泛素阳性包体(图2A). NIID皮肤样本中核内包涵体阳性脂肪细胞的频率约为10%，是3种细胞类型中频率最高的(表格）.
(A)用抗泛素抗体和4 '，6-二氨基氨基-2-苯吲哚二乳酸酯(DAPI)对I族NIID皮肤样本进行双免疫荧光染色。2核内包体用抗泛素抗体(绿色)染色，合并视图中这些包体包含在dapi阳性核内。比例尺= 10 μm。(B-M) NIID家族II抗泛素抗体和DAPI对真皮脂肪细胞的双荧光染色2(B)，正常对照组(C)， charcot - marietooth病(D)，家族性淀粉样多神经病变(E)，亨廷顿病(F)，脊髓小脑共济失调3 (G)，牙状体苍白性萎缩(H)，脊髓和球部肌肉萎缩(I)，肌萎缩性侧索硬化症(J)，帕金森病(K)，多系统萎缩(L)，进行性核上性麻痹(M)。标尺条= 10 μm。
讨论
在家族性NIID患者的h&e染色切片中，我们在脂肪细胞、成纤维细胞和汗腺细胞中观察到核内包体，但由于细胞核的大小和密度，很难观察到包体。采用基于dab的抗泛素抗体免疫组化分析比H&E染色更明显地显示核内包涵体。这些结果表明，抗泛素抗体和DAPI双荧光染色是检测NIID患者皮肤样本核内夹杂物的更可靠的方法，我们推荐该方法用于NIID的诊断。
皮肤样品中脂肪细胞、成纤维细胞、汗腺细胞核内包体在h&e染色切片可见，抗泛素抗体和抗sumo1抗体阳性，呈丝状物质，无极限膜。内含物的这些特征与神经元细胞中NIID内含物的报道相同(图1）.1，- - - - - -，4，9我们认为真皮细胞中的核内包体具有与神经元细胞相似的病理背景，对NIID的诊断有用。此外，由于正常对照样本和其他神经退行性疾病皮肤样本的真皮细胞中未观察到核内包体，皮肤活检是NIID与其他神经疾病鉴别诊断的有力工具。
检查几片双重免疫染色的皮肤样本可能足以诊断NIID，因为脂肪细胞中核内包体的频率约为10%。皮肤活检是一种公认的技术。10它只需要局部麻醉，比直肠活检或腓肠神经活检更安全，更容易，对患者的压力更小。综上所述，我们的结果表明，皮肤活检是一种可接受的、侵入性较小的工具，用于NIID的死前诊断。
信息披露
Sone博士报告没有披露。Tanaka博士获得了日本教育、文化、体育、科学和技术部(2165922,22390175)的科学研究资助基金的研究支持，以及日本卫生、福利和劳动部的资助。小池博士获得了日本教育、文化、体育、科学和技术省(21591076)的科学研究资助基金的研究支持，以及日本卫生、福利和劳动省的资助。Inukai博士没有披露任何信息。Katsuno博士获得了日本教育、文化、体育、科学和技术部科学研究资助(21689024,2110005)的研究支持。吉田博士获得了日本教育、文化、体育、科学和技术省(21500339)的科学研究补助金的研究支持，以及日本卫生、福利和劳动省的补助金。Watanabe博士报告没有披露。Sobue博士担任Kanae科学基金会的科学顾问委员会，促进医学科学，内藤科学基金会，并获得了日本教育，文化，体育，科学技术部(21229011,17025020,09042025)，日本福利，卫生和劳动省，日本科学技术厅，进化科学技术核心研究的研究支持。
脚注
研究经费:由日本教育、文化、体育、科学和技术部的21世纪卓越中心(COE)赠款和全球COE赠款以及日本卫生、福利和劳动部的赠款支持。
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- 肌萎缩性侧索硬化症＝
- 肌萎缩性侧索硬化症；
- CMT＝
- Charcot-Marie-Tooth；
- DAPI＝
- 4, 6-diamidino-2-phenyindole di-lactate；
- DRPLA＝
- 牙齿性苍白性萎缩；
- FAP＝
- 家族性淀粉样多神经病变；
- 高清＝
- 亨廷顿病；
- 他走时＝
- 苏木精和伊红；
- MSA＝
- 多系统萎缩；
- 相当于卫生部＝
- 神经元核内包涵体病；
- PD＝
- 帕金森病；
- PSP＝
- 进行性核上性麻痹；
- SBMA＝
- 脊髓和球部肌肉萎缩；
- SCA3＝
- 脊髓小脑性共济失调
- 收到了2010年8月6日。
- 接受2010年11月17日。
- 版权所有©2011由AAN企业，Inc。
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