文摘
背景和目标Ras-mitogen-activated蛋白激酶(MAPK)信号异常发生在大部分脑动静脉畸形(bAVMs)。不存在分子概要bAVMs没有开放手术,限制精密医学治疗方法。在这里,我们报告使用血管内腔的内腔活检bAVMs描述基因表达和血液流量介导的转录变化生活的病人。
方法内腔活检和计算流体动力学(CFD)进行建模与脑血管造影术成人颅内动静脉。每个病人接受手术切除和细胞从连续的动脉段采样。Fluorescence-assisted细胞分选富集内皮细胞,测序Illumina公司4000年HiSeq编曲。基因表达与RNA序列量化(RNAseq)。差异基因表达、本体论和相关分析。结果验证和定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)。
结果内腔活检成功没有并发症4例。每个切片内腔细胞活检取得了269.0±79.9(309.2±86.6细胞,控制bAVM 228.8±133.4细胞)。RNAseq识别106个差异表达基因(度)bAVMs(错误发现率≤0.05)。度浓缩了bAVM致病,包括Ras-MAPK信号(p< 0.05),证实RT-qPCR和小组预测MAPK /细胞外signal-regulated激酶抑制剂的反应。patient-matched手术切除组织相比,内腔活检发现基因的83.3%,(皮尔森和全基因组表达强烈相关r= 0.77)。壁剪切应力测量了CFD upregulation与炎症相关途径。比较pre-embolization和栓塞形成后样品确认流量介导基因表达的变化。
讨论内腔住患者的活检允许bAVMs的分子分析。基因表达谱类似于组织与开放手术和识别潜在的收购通道Ras-MAPK bAVMs信号异常。与CFD的集成允许测定血流介导转录组变化。内腔活检有助于促进人类bAVMs精密医学试验的方法。
术语表
- 动静脉=
- 动静脉畸形;
- bAVM=
- 脑AVM;
- CBF=
- 脑血流量;
- 计算流体动力学=
- 计算流体动力学;
- 度=
- 差异表达基因;
- DSA=
- 数字减影血管造影;
- 流式细胞仪=
- fluorescence-activated细胞分类;
- 罗斯福=
- 错误发现率;
- MAPK=
- 增殖蛋白激酶;
- MEK=
- MAPK /细胞外signal-regulated激酶;
- qPCR=
- 定量聚合酶链反应;
- RNAseq=
- RNA序列;
- scRNAseq=
- 单细胞RNAseq;
- 鞭打=
- 上壁剪切应力;
- 3 d=
- 三维
一种类型的大脑血管畸形称为动静脉畸形(AVM)是一个纠结的血管形成动脉和静脉之间的直接连接。1脑avm的子集(bAVMs)导致脑出血和脑出血的主要原因在年轻人。2然而,大多数bAVMs不出血。随机对照试验表明,介入治疗如血管内栓塞、立体定向放射治疗,或手术切除与更高的死亡率比观察和中风,和治疗仍存在争议。3
精密医学方法已经彻底改变了临床护理,尤其是在肿瘤。大多数avm(> 95%)被认为是没有明确的遗传原因,4但重新测序的努力最近发现体细胞内激活变异Ras-mitogen-activated蛋白激酶(MAPK)信号通路如原癌基因喀斯特和BRAF在大多数零星bAVMs。5,6靶向抑制Ras-MAPK通路逆转bAVM病理学实验模型和颅外血管畸形进行试验。6,7尽管确定治疗目标的能力,脑立体定向活检技术是不安全的对许多脑血管疾病由于脑出血的风险。因此,分子只在执行分析血管畸形与开放手术切除。这有几个后果:(1)获得的信息对临床决策影响不大;(2)精密医学治疗的指导下的分子概要bAMVs是不可能的;和(3)没有分子信息可以从血管畸形手术切除。因此,目前没有办法提取分子信息从人类生活的脑血管疾病患者。
为了解决这个障碍脑血管精密医学翻译在人类中,我们试图用脑血管造影术,诊断金标准,样品细胞的血管腔内cerebrovasculature。在这里,我们报告我们的系列展示脑angiography-guided内腔活检的可行性和准确性与下一代RNA分子概要bAVMs测序(RNAseq),确定治疗通道途径,推断出血流介导的转录组变化从颅内bAVMs病人的生活。
方法
标准协议的审批、登记和病人同意
人类bAVM样本和临床数据来自旧金山加州大学的协议批准用于人体实验机构审查委员会和伦理委员会(机构审查委员会没有。15 - 16403)。除了标准的外科同意,得到书面知情同意,允许收集额外的线圈在治疗研究的具体目的。的机构审查委员会,正式的停止规则如一个过程性出血性或缺血性中风。
患者筛查门诊和住院普查列表。最初的经验,只有成年人(> 18岁)接受flow-reductive颅内动静脉栓塞为后续显微外科切除AVM都包括在内。排除标准包括目前avm,先前或破裂;存在的高风险特性,例如,从流量动脉瘤、或脑血管解剖不利于导管插入术,如血管弯曲度或不利的主动脉弓解剖学;或动静脉不接受手术切除。临床资料进行了总结表1。
血管内活组织检查
数字减影血管造影(DSA)以标准方式执行一个阿蒂斯问,或者阿蒂斯Zee双翼飞机,血管造影系统(德国西门子Healthineers AG)、Forchheim)。血管内进行活组织检查我们之前的描述。8,9所有患者全身麻醉管理,并施行超声指导下得到的访问。控制股血管造影后,0.035——本森或曲线准绳被通过鞘与髂动脉的内皮细胞,保持在这个位置≈1分钟。丝被,远端3厘米是切割和放置在一个3-mL LoBind埃普多夫微型离心机管包含冷冻细胞分离缓冲(热费希尔科学、沃尔瑟姆,MA)。当时postsampling股血管造影表现排除任何procedure-associated动脉解剖。这个示例作为patient-matched控制从一个冷漠、系统性动脉。
所有病人然后收到一个静脉肝素丸,以确保一个激活凝血时间2倍基线或> 250秒;这是标准做法,以减少血栓栓塞并发症与脑血管造影术。诊断脑血管造影是伸缩式指导和执行microcatheters根据每个患者的脑血管解剖。三维(3 d)执行旋转血管造影术Mark7权力喷射器(MedRad发现,荷兰)注入的主要动脉供应AVM和完全描述AVM的3 d结构。短动脉段1激素喂养的动脉被确定先验作为血管内活检的目标网站。选址取决于几个选择标准:(1)动脉是为了随后被栓塞为了减少流手术第二天;(2)动脉可以安全地访问microcatheter;和(3)动脉段并列AVM病灶(距离<≈1厘米)。病灶不是采样血管内由于程序性风险加剧。
活组织检查现场识别后,超选择性microcatheterization所需的动脉段荧光镜的指导下执行。Microcatheter位置与聚焦血管造影证实。铂金可拆式线圈匹配父容器的大小,通过microcatheter部署,联系船舶腔只有在所需的活检部位。1分钟后腔的接触,线圈resheathed,从保护它的伸缩导管接触其他船段。然后删除线圈是切割和放入3-mL LoBind埃普多夫微型离心机管包含冷冻细胞分裂缓冲区。选择新线圈,线圈栓塞进行常规检查每减少血液流动的AVM打开神经外科切除。血管内活检所示的程序步骤视频1。
计算流体动力学建模
计算流体动力学(CFD)方法被用来计算速度场通过感兴趣的血管和心脏周期。CFD模拟需要准确规范的边界条件,即支架表面几何和进气道流波形通过心动周期。腔的轮廓提取的水平集表示复杂表面的3 d DSA图像获得一个阿蒂斯问,或者阿蒂斯Zee双翼飞机,血管造影系统(西门子Healthineers AG)。图像被转移到一个临床后处理工作站和重建512×512矩阵与一个光滑胡锦涛内核,导致≈0.8毫米实际解决。结果重建3 d DSA卷出口和装上一个研究工作站与可用的CFD建模研究原型(西门子Healthineers AG)。在处理之前,该网站的内腔穿刺活检是明显的3 d体积为了执行CFD分析在同一船段靠近病灶。10
视频1
内腔活检。内腔的视频描述技术与数字减影血管造影的脑动静脉畸形活组织检查。下载补充视频1通过http://dx.doi.org/10.1212/200109_Video_1
原型CFD解算器(西门子Healthineers AG)使用GPU-optimized Lattice-Boltzmann multirelaxation时间近似方法。11,12在这种方法中,不可压缩n - s方程解决了根据有限体积方法,和跳动的速度场(3 d + t,也就是说。在空间和整个心动周期)在0.2毫米的笛卡尔网格计算各向同性空间分辨率。这允许二次测定血流动力学描述符如壁剪切应力。速度波形是改编自流入速度剖面如前所述,基于二维相位对比MRI测量。13,14为了确保收敛,执行计算流/ 2心跳的时间步5×10−4每0.05秒秒,和结果输出。流出边界,是固定的压力为0。血液密度和粘度被假定为0.001 g /毫米3分别和0.004 Pa·s。
打开神经外科抽样
一夜之间,病人被观察到在重症监护室和被带到第二天神经外科手术套件。所有患者在全身麻醉下。颅骨切开术是根据每个患者neuronavigational软件以标准的方式,并与助手的蔡司显微外科切除了OPMI Pentero 800手术显微镜(卡尔蔡司AG)、从、德国)。直接的微观可视化,包括术中吲哚菁绿血管造影,15和确认与neuronavigational软件(BrainLab,慕尼黑,德国)确定喂动脉病灶和动静脉的引流静脉。维持3 d定位、动脉瘤夹和AVM microclips (Aesculap公司,中心山谷,PA)大小不同的动脉被置于直接可视化到喂食的兴趣,包括血管内活检部位和AVM病灶。AVM切除后,AVM microdissected进入动脉段活检部位病灶,每个站点和组织样本被放置在可于冷冻杜尔贝科修改鹰介质(热费希尔科学)和随后的离解运到实验室。
细胞制备和Fluorescence-Activated细胞排序
细胞从血管内活检样本,样本涡30秒缓冲解放细胞,在细胞分裂和切丝或线圈被丢弃。细胞随后被剥离下来,与孵化和红血球细胞溶解ACK赖氨酸缓冲区(热费希尔科学)。细胞被洗和磷酸盐。从开放手术切除组织microdissected与15号手术刀≈1×1毫米立方体和随后的0.2%胶原酶2型(卫氏生化公司,莱克伍德,新泽西)。红血球细胞溶解了孵化的ACK赖氨酸缓冲区,和细胞悬液无菌40-μm过滤器过滤清除残骸和磷酸盐洗。
细胞悬浊液在fluorescence-activated resuspended细胞排序(流式细胞仪)缓冲区和沾染了修改后的协议描述。8,9,16647 -共轭单克隆细胞沾Alexa萤石反CD31抗体(BD生物科学,圣何塞,CA)和4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI热费希尔科学)。随后细胞荧光排序,在BD FACSAria二流式细胞分析仪(BD生物科学)。不能存活的细胞被排除DAPI积极性的基础上,通过积极的选择和内皮浓缩了CD31细胞。可行的为内皮细胞纯度被认为是CD31-positive, DAPI-negative细胞。
图书馆准备和散装RNAseq
图书馆准备和测序对病理样本由调查人员不清楚。互补脱氧核糖核酸序列库都是直接与应用程序创建的红杉完整RNA图书馆准备工具包(Biorad实验室、公司、大力神,CA)所描述的整个细胞作为制造商。核糖体rna耗尽了专有技术postlibrary代(Biorad实验室、公司)。最后的所有库进行了质量控制分析与安捷伦D1000 ScreenTape系统(安捷伦科技,圣克拉拉,CA)和测序Illumina公司HiSeq 4000,单头50个碱基对读,多路复用在6样品/巷。
定量聚合酶链反应
确认RNAseq结果,定量PCR (qPCR)上执行生成的互补。5个差异表达基因的一个子集(度)与最高分由−日志10p价值×abs(β)和生物信息学小组对激活MAPK信号敏感的反应和预测MAPK /细胞外signal-regulated激酶(MEK)抑制剂用于分析。17引物设计与Fluidigm D3分析设计软件的使用18(Fluidigm集团、南旧金山,CA),并给出试验识别在eTable 1中,links.lww.com/WNL/B817。执行qPCR SBYR绿色(罗氏应用科学,潘茨堡,德国)LightCycler 480 II(罗氏应用科学)。相对与δC基因表达进行了计算T方法使用β-actin (ACTB)管家基因。数据意味着4±SD生物复制。
单细胞RNAseq
证实内皮浓缩通过流式细胞仪,我们整理个人CD31-positive DAPI-negative细胞获得通过内腔活组织检查和准备单细胞RNAseq (scRNAseq)库使用Smart-seq2协议在96 -排序细胞如前所述。19最终库进行了质量控制分析与安捷伦D1000 ScreenTape系统(安捷伦科技)和4000测序的Illumina公司HiSeq paired-end 100碱基对。
数据分析
对测序数据,与FastQC测序质量确认,适配器与Cutadapt修剪。读取被pseudoaligned运用GRCh38转录组用Kallisto 100引导样品。20.scRNAseq数据、基因与修数矩阵生成和分析。21检测到的基因被定义为每百万记录。能够与侦探差异基因表达分析,和β作为估计的褶皱变化如前所报道。22基因的错误发现率(罗斯福)的调整值问< 0.05被认为是差异表达。基因本体论分析度FDR-adjusted价值问与EnrichR < 0.1。23体内流建模、皮尔森相关系数是用来推断时均壁面切应力的关系(鞭打)基因表达(表达为记录每百万)为每个记录在个人。基因与相关系数≥0.6或≤−0.6定义相关的基因。所有的数据分析和可视化进行了R 3.6.3版本(R统计计算的基础,维也纳,奥地利)。
数据可用性
匿名数据没有公布在本文将会被要求提供任何合格的调查员。
结果
内腔bAVMs切片检测致病性和通道的分子变化
内腔穿刺活检是执行的所有患者无并发症(图1一个)。病人的人口统计信息了表1。平均269.0±79.9 CD31-positive DAPI-negative可行的细胞恢复/网站(动静脉控制细胞309.2±86.6,228.8±133.4细胞)(表1)。使用流式细胞仪的控制参数,scRNAseq证实浓缩的内皮细胞占细胞的71.9%抽样的基础上规范标记表达式(eFigure 1,links.lww.com/WNL/B817)。RNAseq内腔检查细胞的分析确定了106度(罗斯福< 0.05)(图1 b和eTable 2,links.lww.com/WNL/B817)。路径分析表明,度浓缩了bAVM致病途径如MAPK信号,5,6血管生成(Rho-mediated细胞活性、血清反应因子激活凝血酶信号),24,25和炎症(抗原处理)(图1 c)。26本体论的分子功能分析证实了浓缩的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性和绑定的小gtpase Ras和Rab (图1 c)。
(一)内腔活检是通过图像引导放置的脑血管造影术microcatheter到动静脉畸形(AVM)的腔。然后部署一个白金线圈、联系和消除动脉的细胞衬里。线圈被移除,随后fluorescence-activated内皮细胞分类丰富。图由Probst肯尼斯·泽维尔。(B)火山的RNA序列基因表达AVM和patient-matched冷漠。β的影响大小。(C)条形图显示分析本体论的差异表达基因。橙色表示信号通路;蓝色,分子功能。罗斯福=错误发现率; ICA = internal carotid artery; MAPkinase = mitogen-activated protein kinase; MCA = middle cerebral artery; NTP = nucleoside triphosphate; SRF = serum response factor.
来证实这些发现,我们接下来进行逆转录qPCR分析来验证度和MAPK激活。我们确认5基因的微分表达式(NBPF19,IFITM1,FBLX18,TNFRSR10C,MARCHF8十大最度(中)图2一个)。我们研究MAPK激活基因小组独立证明还预测响应MEK抑制剂在人类癌症。17这个分析显示统计学意义upregulation 7 10基因支持MAPK激活(图2 b)。因此,内腔活检复苏主要细胞分子事件反映血管畸形,使直接的分子分析和识别潜在的治疗目标而不需要手术。
内腔活检密切接近从手术切除avm基因表达分析
我们下一个试图比较基因表达谱得到内腔与手术活检细胞获得组织相同的患者,一个重要的技术验证基准。我们优化的显微外科技术保护的3 d定位bAVM并确保取样活检部位的动脉段连续的(图3一)。RNAseq分析表明,内腔切片检测绝大多数(83.3%)的基因中确定手术组织(图3 b)。基因表达谱的内腔和手术获得细胞的全基因组(皮尔森相关r= 0.77,图3 c),支持技术之间的良好一致性。很强的相关性也观察到RNAseq喂养动脉之间的基因表达和手术病灶获得bAVMs(皮尔森r= 0.95,图3 d)。这支持内腔抽样从动脉更容易juxtanidal喂养等网站的代表分子概要文件在AVM病灶没有添加程序的风险。
将CFD建模允许内腔切片分析基因表达变化与脑血流量的改变
血流动力学改变与脑血流量(CBF)如壁剪切应力与血管壁重构和风险相关联的大脑在bAVMs出血或出现神经症状。27,- - - - - -,29日调查如何CBF改变了转录组、CFD建模从大脑血管造影是用于计算鞭打的地点和时间内腔从脑造影(活组织检查图4一和视频2)。在个人,好鞭打与RNAseq基因表达之间的相关性被发现在11.0%的成绩单(图4 b)。我们确定了通路和皮鞭的一种积极的还是消极的联系。这个分析显示浓缩的炎症和结构途径与鞭打负相关(罗斯福< 0.05)(图4 c)。本体论的分子功能分析显示,绑定浓缩RNA和蛋白激酶和肌动蛋白和钙粘蛋白等细胞骨架元素,符合调节变化(图4 c)。
视频2
血管壁剪切应力与心动周期。视频计算流体动力学模拟血管壁剪切应力超过心动周期内腔的活检在喂养动脉脑动静脉畸形。下载补充视频2通过http://dx.doi.org/10.1212/200109_Video_2
(A)三维旋转血管造影与计算流体的动态剪切应力建模脑血管造影在动静脉畸形(AVM)活检的动脉。注入椎动脉。(B)基因的表达。饼图显示flow-correlated(橙色)和noncorrelated(蓝色)基因的表达。(C)丰富。实体论的分析信号通路(橙色)和flow-correlated基因的分子功能(蓝色)。离开时,负相关;对的,呈正相关。负相关通路被激活预计将较低的剪切应力。呈正相关通路和高剪切应力预计将被激活。 (D) Change after embolization. Boxplot of gene expression changes (Δ) after flow-reductive embolization. Orange indicates genes negatively correlated with shear stress; blue, genes positively correlated with shear stress. CDK = cyclin-dependent kinase; IL22 = interleukin-22; NDK = nucleoside-diphosphate kinase; NO = nitric oxide; PI3K = phosphoinositide 3-kinase; TAWSS = time averaged wall shear stress; TCR = T-cell receptor. *p< 0.05。
栓塞是一种血管内手术的一种闭塞的材料如铂线圈或液体粘合剂可以减少血液流动和bAVM壁剪切应力。30.来,是想确定一下我们生活的预测病人,我们接下来评估flow-reductive栓塞对体内基因表达的影响。RNAseq分析相同的内腔活检bAVM动脉段栓塞前后确认微分表达式少数成绩单(7.3%)。符合我们相关分析、基因剪切应力呈负相关,例如,表达预测增加剪切应力较低,减少调节响应流(图4 d)。相比之下,与剪切应力是表达下调基因相关的积极响应,减少流(图4 d)。与CFD的集成建模与基因表达分析,内腔活检可能促进未来调查了解改变CBF分子变化可能影响脑血管病人的生活。
讨论
在这里,我们报告在人类使用的内腔活检来分子概要bAVMs病人的生活。我们证明了基因表达谱检测致病性和潜在通道分子bAVMs变化不需要侵入性手术。重要的是要注意,有很好的一致性在基因表达分析通过血管内活检相比,手术切除组织(金标准)。我们的研究结果进一步支持异常参与Ras-MAPK信号在成人bAVMs之前报道。5,6等有针对性的途径抑制MEK抑制剂逆转病理bAVM内皮体外和体内的变化,在进行颅外血管畸形。6,7我们的结果表明,我们能够检测基因表达改变预测响应MEK抑制在人类癌症。17这个预测是否响应人类bAVMs MEK抑制还有待确定,值得未来研究。
将CFD建模显示一个协会的剪切应力与基因表达变化,证实了比较pre-embolization和栓塞形成后基因expression-an干预人类患者体内调节剪切应力。这些分析支持前体外工作支持的调节作用剪应力内皮炎症或细胞骨架变化。30.,- - - - - -,32其他人认为生理切应力是重要的其他结构元素,如血脑屏障。33,34然而,我们的观察仅限于焦段动脉的内腔活检,使这些研究结果的解释和普遍性。bAVMs内血流动力学环境是非常复杂的,目前知之甚少。35,36四维流核磁共振等新兴技术和定量核磁共振血管摄影开始阐明bAVMs内血流动力学的改变。27,30.,37内腔活检时结合CFD或定量核磁共振可以作为实验平台开始阐明bAVMs内血流动力学改变和cellular-molecular变化之间的接口。
目前的研究是第一步在描述应用程序内腔的活检分子描述bAVMs生活病人和并非没有限制,尤其是小样本容量和单中心设计。所有结果应该被认为是初步的,直到进一步独立确认从其他中心确认普遍性。我们的小样本大小表明最初的可行性,但动力不足来确定病人的安全。在努力验证内腔活检,比较是用手术样本细胞相同的病人。尽管最小化之间的时间间隔内腔采样和手术切除(< 24小时),炎症和血栓形成的途径可能是导致一些观察到的细胞内腔和手术样本之间的差异。不确定性安全与内腔活检技术还禁止收集冷漠脑动脉。之间的比较进行内皮是从bAVM喂养外动脉和动脉patient-matched cerebrovasculature站点附近的访问(例如,髂动脉)。转录差异不同血管内皮的床已经被报道38,39并有可能导致观察到的基因表达差异。安全概要文件成为更好的建立,设计未来的内腔活检研究应该没有与冷漠大脑血管栓塞和应该执行比较来证实这些发现。
一个关键的下一步是执行大,多中心研究,以确定手术安全性和并发症与内腔活检资料。流行的安全问题是内腔活检将促进血栓形成或损害血管结构完整性,分别导致缺血性或出血性卒中发生。永久性的神经系统并发症的风险与诊断脑血管造影术由于缺血性或出血性卒中发生< 1%。40,41临床前测试表明,部署的可拆式线圈获取细胞不会导致血管造影或微观损伤动脉采样。8我们也采用分层策略来减轻缺血的风险:(1)全身肝素化活检之前,(2)避免与线圈部署流量限制,(3)内皮限制接触时间为1分钟,和(4)荧光镜的监测潜在血栓形成后立即与线圈部署或活检。与我们日益增长的制度经验,我们还没有遇到一个程序性的并发症与内腔活检应用这些策略。然而,执行内腔的添加剂风险活检诊断脑血管造影在人类患者目前仍没有量化。
在临床实验室诊断分子基因组学继续发展,特别是神经肿瘤学学会举办内部。除了对MEK的反应抑制的PCR小组预测,17本研究使用RNAseq和计算工具,很难使用在较大的临床设置。正在进行的调查已经开始识别分子多样性bAVMs自然的历史,以及它如何与不同。5,6,42随着候选基因列表变得更好的定义,下游面板分析应该使用更有针对性的基因预测治疗反应或破裂的风险,和我们目前迭代产生一个更有针对性的测试,不是依赖全基因组或exome-wide测序。
临床决策治疗或监测血管畸形目前知情与不完美的放射或临床代理人,这可能会导致不同的自然历史。43内腔活检进一步发展,然而,它可能会直接分类或连续监测血管畸形或其他血管疾病分子,就像一个肿瘤。药物治疗在随机对照试验有良好的安全性,3和内腔活检理论上可以帮助识别候选目标precision-based方法显示承诺在实验模型。6,7内腔活检是否会促进精密医学疗法的试验在人类患者或更好地识别血管畸形出血的风险最大,需要进一步调查。
研究资金
已经支持大脑血管畸形财团(BVMC)试点可行性项目赠款和辛西娅·林恩·舍温和巴兹BAF主席研究脑动脉瘤的基金会的资助。BVMC (U54NS065705)是国家推进中心的一部分转化科学罕见疾病临床研究支持网络(RDCRN)和RDCRN数据管理和协调中心(U2CTR002818)。华盛顿支持通过加州大学旧金山分校放射学和生物医学成像,加州大学旧金山分校的研究评价和分配委员会授予和西门子Healthineers AG)。支持K.N. BVMC职业生涯早期增强奖(U54NS065705)。
信息披露
作者报告没有披露相关的手稿。去半岛投注体育官网Neurology.org/N为充分披露。
承认
作者感谢肯尼斯·泽维尔Probst插图图1。
附录的作者
脚注
↵*这些作者的贡献同样和共同通讯作者。
去半岛投注体育官网Neurology.org/N为充分披露。资金信息和披露认为作者相关的,如果有的话,年底提供这篇文章。
这篇文章加工费由作者。
- 收到了2021年6月3日。
- 接受的最终形式2022年1月11日。
- 版权©2022年作者(年代)。发表的Wolters Kluwer健康,公司代表美国神经病学学会。半岛投注体育官网
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