文摘
目的:视Neuromyelitis(动)免疫球蛋白G(免疫球蛋白)(aquaporin-4 AQP4免疫球蛋白)是高度特定的动及相关疾病,和自身抗体检测已成为一个重要的调查患者的脱髓鞘疾病。然而,尽管不同的技术现在使用,没有进行多中心的比较。本研究比较了不同检测的敏感性和特异性,包括内部流仪测定和2商业化验(ELISA和转染细胞试验(CBA))。
方法:6个试验方法(内部或商业)进行国际中心2使用编码从动(35例)患者血清,动谱系障碍(25例),复发缓和多发性硬化(39例),其他自身免疫性疾病(25例)和健康受试者(22科目)。
结果:敏感性最高,被化验检测了免疫球蛋白结合细胞表达重组AQP4与定量流式细胞术(77;46 60)或视觉观察(CBA, 73%;44 60)。荧光免疫沉淀反应试验和组织免疫荧光试验是最敏感(48% - -53%)。CBA和ELISA商业化验(具体100%)产生了68%的敏感性60(41)和60%(60)36,分别时,敏感性为72%(43 60)结合使用。
结论:更大的敏感性和良好的特异性检测的第二代重组antigen-based化验NMO-IgG在临床设置应能使动谱系障碍的早期诊断和及时启动disease-appropriate疗法。
术语表
- AQP4=
- aquaporin-4;
- CBA=
- 细胞试验;
- E=
- EUROIMMUN;
- 流式细胞仪=
- fluorescence-activated细胞分类;
- FIPA=
- 荧光免疫沉淀反应试验;
- 免疫球蛋白=
- 免疫球蛋白G;
- 国际金融协会=
- 间接免疫荧光法;
- 米=
- 梅奥;
- 女士=
- 多发性硬化症;
- 动=
- 视neuromyelitis;
- NMOSD=
- 视neuromyelitis谱系障碍;
- O=
- 牛津大学;
- R=
- RSR / Kronus;
- 中华民国=
- 接受者操作特性曲线
视Neuromyelitis(动)是一种严重的复发中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病,主要影响视神经和脊髓。1在演讲中,最常见的鉴别诊断是多发性硬化症(MS)。但是,与女士,残疾与每个动产生攻击。因此,早期诊断和治疗是至关重要的。2发现特定的免疫球蛋白G抗体(免疫球蛋白)绑定到中枢神经系统病患膜确认目标是水通道aquaporin-4 (AQP4),辅助疾病的早期识别和扩大的临床表现包括病人只有视神经炎或横向脊髓炎(视neuromyelitis谱系障碍[NMOSDs])。3,4体外和体内的研究已经证明了这些自身抗体的致病潜力。5,- - - - - -,10然而,不同的化验检测患者血清中AQP4-IgG动和其他NMOSDs敏感性不同。3,4,11,- - - - - -,17在这个国际多中心研究中,6种AQP4-IgG化验编码样本进行比较。
方法
标准协议的审批、登记和病人同意。
本研究机构审查委员会批准的所有3。
病人。
血清样本146例和对照组进行重复测试,和35个病人完成了Wingerchuck诊断标准为正常时差(1999或2006(不包括抗体状态))。2的患者中,25名被调查人员分类为NMOSDs;这组包括14纵向广泛的横向脊髓炎患者复发(9)和8例视神经炎(5复发;所有单一攻击例视神经炎患者血清反应阳性的)。86控制与其他疾病(健康对照组和64年22日[满足麦当劳标准复发缓和女士,39;干燥综合征,1;系统性红斑狼疮,4;风湿性关节炎,1;脊髓硬膜动静脉漏管,4;noninflammatory脊髓病,3;短segment-longitudinal横向脊髓炎,2; sarcoid longitudinally extensive transverse myelitis, 1; polyclonal hypergammaglobulinemia, 1; and other, 8]) were also tested. The samples were provided by 3 institutions: Mayo Clinic, Rochester MN (93 patients), Neuroimmunology Group, Nuffield Department of Clinical Neurosciences, Oxford, UK (39 patients); and McGill University, Montreal, Canada (14 patients). For longitudinal analysis of antibody titers, 9 serum samples taken over 5 years from a single patient with NMO were analyzed.
所有样本提交给麦吉尔大学,整除,记录,并返回冷冻的其他2中心。梅奥诊所(Mayo Clinic)的测试包括一个组织的间接免疫荧光法(IIF) NMO-IgG化验,3ELISA-R (RSR / Kronus,所提供的有限公司;制造商的推荐水平血清阳性,5 U /毫升或更大),GFP-AQP4荧光免疫沉淀反应试验(FIPA-M)。13,18牛津大学测试包括荧光免疫沉淀反应试验(FIPA-O),11视觉fluorescence-observation细胞试验(CBA-O),11,18和一个新的定量流式细胞术(fluorescence-activated细胞排序(流式细胞仪))测定。结果发送到麦吉尔大学的合著者(A.B-O)解码。随后,两个实验室执行,根据制造商的指示(EUROIMMUN),视觉fluorescence-observation细胞试验(CBA-E)合并固定HEK293细胞转染单独与人类AQP4-M1或M23同种型。15细节上的方法发现发表在附录e 1半岛投注体育官网®网站www.半岛投注体育官网neurology.org。
流式细胞术。
36小时后HEK293细胞转染质粒编码人类AQP4与荧光蛋白域,使胰蛋白酶化细胞,在杜尔贝科resuspended修改鹰的媒介,1%胎牛血清,1毫米EDTA(流式细胞仪缓冲区)1.0×106细胞/毫升,旋转在4°C 2小时。病人血清(1:10稀释在流式细胞仪缓冲区)和1.0×105细胞(100μL)。控股在4°C 15分钟后,细胞被洗,结合免疫球蛋白检测用Alexa 488 -标记反人类的免疫球蛋白(1:50 0稀释在流式细胞仪缓冲区)。这些细胞被resuspended 30分钟后在400年μL磷酸盐/ 5毫米FACSCalibur EDTA和分析。转染的水平是由测量域强度(PE-Texas红色通道)在活细胞(图e 1, y轴)。两个盖茨创建:更高的门捕获细胞表达高水平的安全域(如图e 1标记R5);捕获的下游闸门untransfected或低转染细胞(标记为如图e 1 R7)为每个样本和作为消极的控制。在绿色通道绑定免疫球蛋白测定(转向正确的轴)。得分为每个血清是由减去中间绿色荧光的门从绿色荧光中值更高的门。
统计分析。
我们用接受者操作特征曲线(ROC)分析确定ELISA-R事后最优截止值测定最大化疾病敏感性和特异性,并分析所有数据使用SAS 9.1版。McNemar检验法的考验搭配比例是用来比较敏感的流式细胞仪,CBA-Oxford,和ELISA-R Bonferroni调整为多个比较。
结果
分析基于绑定的HEK293细胞转染与AQP4免疫球蛋白被证明是最敏感的(图1和2一):流式细胞仪(77%;46个60),CBA-O (73%;44 60)和CBA-E (68%;41 60)。ELISA-R是下一个最敏感的60 (60%:36)。FIPAs和组织的IIF试验至少敏感(48% - -53%)(表1,图2A)。2商业分析相结合(ELISA-R和CBA-E)确定72%(43 60)动/ NMOSD样本不积极和假阳性(表2)。Interassay和合总体非常好(图2一个);28的60个样本阳性化验,而且只有2 (FIPA-M)遇到假阳性结果。
的散点图6与图中显示为虚线化验。ELISA-R 2被切断,推荐截止(5 U /毫升)和修改截止(1.6 U /毫升)。CBA =细胞试验;DC =疾病控制;流式细胞仪= fluorescence-activated细胞排序;FIPA =荧光免疫沉淀反应分析;傅=荧光单位;HC =健康对照组;IIF =间接免疫荧光法;M =梅奥诊所; ΔMGFI = difference in median green fluorescence intensity; NMOSD = neuromyelitis optica spectrum disorder; O = Oxford.
积极的样本标记+橙色背景。负样本标记——白色背景。纵向广泛的横向脊髓炎(LETM TM)样品是用蓝色突出显示;复发性视神经炎(罗恩)粉红色。(B)荧光免疫沉淀反应化验的结果(FIPAs),表现在两个中心9日一名患者的样本绘制与时间,证明这个简单的试验的一致性监控系列样品。AUC =曲线下的面积;CBA =细胞试验;E = EUROIMMUN;流式细胞仪= fluorescence-activated细胞排序;傅=荧光单位; IF = immunofluorescence; M = Mayo Clinic; O = Oxford; ROC = receiver operating characteristic curve.
事后ROC分析ELISA-R原始数据显示,通过降低截断值从5.0 U /毫升1.6 U /毫升,敏感性可能会从60%上升到70%。一个额外的60例正常时差6或NMOSD然后得分是积极的(图2一个,表2)。所有6积极了流式细胞仪和CBA-O 5 CBA-E积极;然而,也有2假阳性结果(1健康控制和1复发缓和多发性硬化症患者)。后面这两个假阳性细胞化验样品测试呈阴性反应。
诊断化验,FIPAs不是很敏感,但是他们发现适用于串行决定(图2B)。九从单个病人血清样本接管5年也测试蒙蔽。FIPAs显示2之间惊人的再现性测试实验室和抗体水平和治疗反应之间的正相关关系。AQP4-IgG值后下降一个注入利妥昔单抗(利妥昔单抗),慢慢地增加在接下来的20个月。第二个注入利妥昔单抗(利妥昔单抗)减少了AQP4-IgG几乎检测不到的水平。
讨论
敏感和具体检测NMO-IgG (AQP4-IgG)已成为一个不可或缺的实验室调查评估患者中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病,因为血清阳性的诊断,预后和治疗的影响。有几种不同的方法来检测这些自身抗体,也没有以前的国际多中心比较研究已经完成。在这个完全失明的研究中,我们评估不同的化验,包括小说内部流式细胞仪法和2最近化验(ELISA-R和CBA-E)商用工具包。
内部的流式细胞仪和CBA-O试验证明是最敏感的。有显著差异的敏感性这些化验和ELISA-R之间。然而,减少推荐截止ELISA-R从5.0 U /毫升1.6 U /毫升消除这些显著差异(表3),但稍微减少了ELISA-R特异性。组织的IIF化验诊断化验和FIPA并非最优,因为较低的敏感性(48% - -53%)。
全球AQP4-IgG测试的需求正在增加。在过去的12个月里,梅奥诊所的神经免疫学实验室测试了20334名患者的血清AQP4-IgG在服务的基础上,3500年牛津大学的实验室测试。所需的专业知识和资源来执行流式细胞术检测排除在小规模临床诊断实验室使用。这项研究确认,商用设备化验(ELISA-R和CBA-E)都是敏感和特定AQP4-IgG检测。他们相对简单,最少的试剂需求,和顺从目前自动化平台允许nonspecialized实验室提供敏感和具体AQP4-IgG测试。这项研究表明CBA-E可以作为一个方便的常规分析。ELISA-R, 1.6 U /毫升的截断值较低,可能是一个敏感的筛查工具,但血清屈服值1.6和4.9 U /毫升之间需要确认由CBA-E特异性检测。
分析改进的频率减少了NMO-IgG seronegativity。重要的是要确定不同的中枢神经系统的免疫球蛋白g抗原特异性可能占NMOSD患者缺乏可检测AQP4-IgG。必不可少的先决条件是最大化AQP4-IgG试验敏感性排除假阴性。流式细胞仪测定似乎最有用的在这一研究背景下,而FIPA纵向监控病人可能更方便。功能分析是有前途的收益率数据可能与疾病严重程度和预测复发。19
作者的贡献
研究设计和概念化:P.J.W.,A.B.-O。,年代。P。Drafting of manuscript: P.J.W., S.J.P. Acquisition, analysis and interpretation of data: P.J.W., A.M., M.I.L., S.R., V.A.L, A.V., J.P., J.N.M., A.Villalobos, A.B.-O., S.J.P. Statistical analysis: P.J.W., J.N.M., S.J.P. Critical revision of the manuscript: P.J.W., A.M., M.I.L., S.R., V.A.L., A.Villalobos, J.P., J.N.M., A.Vincent, A.B.-O., S.J.P.
信息披露
水域博士是一个命名的发明人的专利相关的化验检测抗体Lgi1, Caspr2, Contactin2并为这种技术可能会收到版税。水域接收博士研究牛津NIHR生物医学研究中心的支持。麦肯接收博士研究Guthy杰克逊慈善基金会的支持。雷特博士接收来自牛津大学生物医学研究中心,研究支持国家委托集团和英国哈雷·斯图尔特爵士的信任,。Rajasekharan博士报告没有披露。列侬博士是一个命名的发明人的专利涉及aquaporin-4抗体诊断neuromyelitis视和收到版税技术;是一个名叫发明人的专利与功能性AQP4 / NMO-IgG化验和NMO-IgG作为癌症标记;和接收研究Guthy杰克逊慈善基金会的支持。维拉波斯a .报告没有披露。宫博士是默克公司Serono科学顾问委员会,拜耳先灵葆雅制药、Idec,梯瓦制药产业有限公司,诺华公司和赛诺菲-安万特; has received funding for travel from Merck Serono; and receives research support from the Multiple Sclerosis Society and the Department of Health Risk Sharing Scheme (Clinical Coordinator). Dr. Mandrekar reports no disclosures. Dr. Vincent is a named inventor on a patent relating to assays for the detection of antibodies to Lgi1, Caspr2, and Contactin2 and may receive royalties for this technology. Dr. Vincent has served on scientific advisory boards for the Patrick Berthoud Trust and the Myasthenia Gravis Foundation of America; has received funding for travel and a speaker honorarium from Baxter International Inc.; serves as an Associate Editor for大脑;接收来自出版版税临床神经免疫学(布莱克威尔出版社,2005)炎症和自身免疫性疾病的儿童的神经系统(Mac基斯出版社,2010年);接收来自欧盟的研究支持,牛津NIHR生物医学研究中心,和哈雷·斯图尔特爵士信任;和已经收到了麝香抗体版税从雅典娜诊断和咨询费用,公司和麝香抗体版税RSR有限公司,英国卡迪夫。牛津大学A.V.所在地,收到版税支付抗体检测在神经系统疾病。博士酒吧或者是科学顾问委员会BioMS医疗、DioGenix, Inc .,小野制药有限公司,葛兰素史克,罗氏,Guthy杰克逊更良好的基础研究和临床护理与动财团;在编辑的董事会半岛投注体育官网®和临床和实验神经免疫学;已经收到Idec,议长谢礼Bayhill疗法,拜耳先灵葆雅制药(Berlex),礼来公司,基因泰克,Inc .)、葛兰素史克、默克公司Serono,诺华,惠氏,赛诺菲-安万特(sanofi - aventis)和梯瓦制药产业有限公司;和接收/收到BioMS医学研究支持,默克公司Serono, Bayhill疗法,Idec,基因泰克,Inc .和梯瓦制药产业有限公司Pittock博士是一位名叫发明人的专利与功能性AQP4 / NMO-IgG化验和NMO-IgG作为癌症标记;接收研究支持Alexion制药公司,Guthy杰克逊慈善基金会和美国国立卫生研究院。
承认
作者感谢约翰·梅奥诊所史迈林进行化验和援助与数据分析,凯文·克拉克的建议与流式细胞术(WIMM,牛津),博士Klaus-Peter扫读博士和基督教Probst (EUROIMMUN)提供EUROIMMUN CBA幻灯片,和秩/ Kronus提供AQP4 ELISA-R板。
脚注
研究经费:部分支持Guthy-Jackson慈善基金会和国家卫生研究院(NS065829-01)。P.J.W.,M.I.L., J.P., and A.Vincent are supported by the NIHR and the NIHR Oxford Biomedical Research Centre.
- 收到了2011年5月19日。
- 接受2011年8月12日。
- 版权©2012年长企业公司,。
